Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Hirnorganoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Um Gehirnorganoide in großen Mengen und von hoher Qualität zu erhalten, verwenden wir hausgemachte Mini-Bioreaktoren.

Zusammenfassung

Das iPSC-abgeleitete Gehirnorganoid ist eine vielversprechende Technologie für die In-vitro-Modellierung der Pathologien des Nervensystems und das Drogenscreening. Diese Technologie ist in letzter Zeit entstanden. Es steckt noch in den Kinderschuhen und hat einige noch ungelöste Einschränkungen. Die derzeitigen Protokolle erlauben es nicht, Organoide konsistent genug für die Entdeckung von Medikamenten und präklinische Studien zu erhalten. Die Reifung von Organoiden kann bis zu einem Jahr dauern, was die Forscher dazu veranlasst, mehrere Differenzierungsprozesse gleichzeitig zu starten. Es verursacht zusätzliche Kosten für das Labor in Bezug auf Platz und Ausstattung. Darüber hinaus haben Hirnorganoide oft eine nekrotische Zone im Zentrum, die an Nährstoff- und Sauerstoffmangel leidet. Daher verwenden die meisten aktuellen Protokolle ein zirkulierendes System für Kulturmedium, um die Ernährung zu verbessern.

Mittlerweile gibt es keine kostengünstigen dynamischen Systeme oder Bioreaktoren für die Organoidkultivierung. Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Gehirnorganoiden in kompakten und kostengünstigen hausgemachten Mini-Bioreaktoren. Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Organoide in großen Mengen.

Einleitung

Humane iPSC-abgeleitete Modelle werden häufig in den Studien zu neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen verwendet¹. In den letzten zehn Jahren ergänzten 3D-Hirngewebemodelle, sogenannte Hirnorganoide, im Wesentlichen traditionelle 2D-neuronale Kulturen². Die Organoide rekapitulieren bis zu einem gewissen Grad die 3D-Architektur des embryonalen Gehirns und ermöglichen eine präzisere Modellierung. Viele Protokolle werden für die Erzeugung von Organoiden veröffentlicht, die verschiedene Gehirnregionen repräsentieren: Großhirnrinde^3,4,

Protokoll

ANMERKUNG : Verwenden Sie sterile Technik während des gesamten Protokolls, mit Ausnahme der Schritte 1.2 und 1.3. Erwärmen Sie alle Kulturmedien und Lösungen auf 37 °C, bevor Sie sie auf Zellen oder Organoide auftragen. Kultivieren Sie Zellen in_einem CO 2-Inkubator bei 37 °C bei 5%_CO2 bei 80% Luftfeuchtigkeit. Das Protokollschema ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Petrischalen in Mini-Bioreaktoren verwandeln

1. Schneiden Sie sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen in Ringe von 7-8 mm Höhe; Autoklavieren Sie die Ringe.
2. Adhäsionsarme, unbehandelte oder mikrobiolog....

Ergebnisse

Das Protokollschema ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll umfasste fünf Medien, in denen sich iPS-Zellen während mindestens eines Monats in Gehirnorganoide differenzierten. Die Differenzierung wurde gestartet, dann erreichten iPS-Zellen den 75-90%igen Zusammenfluss (Abbildung 2A,B). Die ersten Anzeichen einer Differenzierung in Richtung Neuronen wurden an den Tagen 10-11 der iPSC-Kultivierung in Medium A beobachtet, als zellen begannen, .......

Diskussion

Das beschriebene Protokoll besteht aus zwei entscheidenden Schritten, die die Erzeugung hochwertiger Organoide einheitlicher Größe ermöglichen. Erstens wachsen die Organoide aus Sphäroiden, die in Zellzahl und Zellreife nahezu identisch sind. Zweitens bieten die selbstgebauten Bioreaktoren jedem Organoid eine einheitliche Umgebung, in der sich Organoide nicht drängen oder zusammenkleben.

Die Zellqualität und der Zustand der Zellreifung sind für die Durchführung des Protokolls unerlässlich. Es .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-Well-Kulturplatte mit Mikrowells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronales Supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-Alanyl-L-Glutamin
Humanes BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serumersatz	Gibco	10828028	Serumersatz
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotentes Stammzellmedium
N2 Supplement	Gibco
Neurobasales Medium	Gibco	21103049	Basalmedium zur Erhaltung neuronaler Zellen
Penicillin-Streptomycin Lösung	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimikrobielle Mittel
Purmorphamin	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StielMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
Stiel MACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
Stiel MACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypanblau Lösung	Gibco	15250061
Versen Lösung	Gibco	15040066	0,48 mM EDTA in PBS
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010

17502001