Følgende protokoll beskriver utvikling og optimalisering av en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning for ormdyrking, fluorescensavbildning og automatisert bildebehandling for å kvantifisere polyglutaminaggregater som en vurdering av endringer i proteostase.
En økning i forekomsten av nevrodegenerative proteinkonformasjonssykdommer (PCD) har fostret stor interesse for dette emnet gjennom årene. Denne økte oppmerksomheten har krevd diversifisering og forbedring av dyremodeller som er i stand til å reprodusere sykdomsfenotyper observert hos mennesker med PCD. Selv om murine modeller har vist seg uvurderlige, er de dyre og er forbundet med arbeidskrevende metoder med lav gjennomstrømning. Bruk av Caenorhabditis elegans nematodemodell for å studere PCD-er har blitt rettferdiggjort av dens relative enkle vedlikehold, lave kostnader og raske generasjonstid, noe som muliggjør applikasjoner med høy gjennomstrømning. I tillegg gjør høy bevaring mellom C. elegans og menneskelige genomer denne modellen til et uvurderlig oppdagelsesverktøy. Nematoder som uttrykker fluorescerende merkede vevsspesifikke polyglutamin (polyQ) kanaler utviser alders- og polyQ lengdeavhengig aggregering preget av fluorescerende foci. Slike reportere blir ofte brukt som stedfortredere for å overvåke endringer i proteostase på tvers av vev. Manuell aggregert kvantifisering er tidkrevende og begrenser eksperimentell gjennomstrømning. Videre kan manuell foci-kvantifisering introdusere skjevhet, da samlet identifikasjon kan være svært subjektiv. Her ble en protokoll bestående av ormdyrking, bildeinnsamling og databehandling standardisert for å støtte høy gjennomstrømningsaggregatkvantifisering ved bruk av C. elegans som uttrykker tarmspesifikk polyQ. Ved å implementere en C. elegans-basert bildebehandlingspipeline ved hjelp av CellProfiler, en bildeanalyseprogramvare, har denne metoden blitt optimalisert for å skille og identifisere individuelle ormer og nummerere deres respektive aggregater. Selv om automatiseringsbegrepet ikke er helt unikt, er behovet for å standardisere slike prosedyrer for reproduserbarhet, eliminering av skjevhet fra manuell telling og økt gjennomstrømning høyt. Det forventes at disse metodene drastisk kan forenkle screeningsprosessen av store bakterielle, genomiske eller narkotikabiblioteker ved hjelp av C. elegans-modellen .
Aldersavhengige nevrodegenerative proteinkonformasjonssykdommer (PCD) som Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdommer, eller amyotrofisk lateral sklerose, er preget av proteinfeilfolding som fører til aggregering, celledød og vevsdegenerasjon1. Mens protein misfolding er anerkjent som den skyldige, er etiologien til disse sykdommene ikke klar. Som sådan har utviklingen av effektive terapier blitt hindret av mangel på kunnskap om faktorer og forhold som bidrar til sykdomsutbrudd og progresjon. Nylige studier tyder på at endringer i mikrobiomet påvirker utbruddet, progresjonen og alvorlighetsgraden av PCD 2,3,4. Kompleksiteten til det menneskelige, eller til og med murine, mikrobiomet gjør det imidlertid vanskelig å gjennomføre studier som vil avsløre den nøyaktige innflytelsen av mikrober på verten. Derfor brukes enklere organismer, som Caenorhabditis elegans, ofte som et oppdagelsesverktøy 5,6,7,8. Nyere studier har benyttet C. elegans for å undersøke effekten av bakterier på vertsproteostase og sykdomspatogenese 9,10. Bakteriell kolonisering, hormesis og genomiske endringer er blant eksempler på forhold som påvirker aggregering av polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. I tillegg viser disse feilfoldede proteinklyngene polyQ lengde- og aldersavhengig akkumulering i verten og er forbundet med nedsatt motilitet 9,13. Den relativt enkle tilnærmingen til å kvantifisere fluorescerende merket puncta kan generere viktige data om forhold, faktorer eller legemidler som påvirker proteinfolding og aggregering.
Selv om kvantifisering av fluorescerende puncta har vist seg å være en pålitelig og relativt enkel prosedyre, er utfordringen fortsatt å utvikle en protokoll som vil lette storskala screening av forbindelser, bakterier eller forhold som påvirker proteinaggregering. Konseptet med automatisert C. elegans bildebehandling og puncta kvantifisering er ikke helt nytt, da en rekke praktiske støtteverktøy er utviklet14,15. Integrering av dyrking, bildeinnhenting og en behandlingspipeline er imidlertid avgjørende for å eliminere variasjon i resultater og muliggjøre skjermer med høyere gjennomstrømning.
Som sådan er hensikten med dette manuskriptet å standardisere prosedyren som brukes til å kvantifisere polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy for å oppdage endringer i proteostase. Denne oppgaven ble oppnådd ved å bruke CellProfiler, en åpen kildekode bildeanalyseprogramvare16 som er i stand til automatisert orm- og aggregatidentifikasjon, og er integrert i en større protokoll for dyrking av ormer, anskaffelse av bilder og behandling av data.
Den beskrevne protokollen skisserer prosedyrer for C. elegans dyrking, bildebehandling og bildebehandling som inkorporerer CellProfiler, en åpen kildekode-bildeanalyseprogramvare. De representative resultatene viser reproduserbarhet, reduksjon av skjevhet og skalerbarhet. Denne standardiserte prosedyren vil forbedre screeningstrategier som brukes med store bakterielle, genomiske eller narkotikabiblioteker. Mens andre automatiserte C. elegans metoder for objektdeteksjon eksisterer, tilbyr den beskrevne teknikken en standardisert, høyere gjennomstrømningsrørledning som integrerer dyrking, bildeoppkjøp og analyse.
Flere varianter av ormdyrking måtte testes for å optimalisere protokollen beskrevet her. I utgangspunktet ble ormer overført til prøvebakterier umiddelbart etter alderssynkronisering (L1-stadium). En slik tilnærming resulterte imidlertid i en populasjon av ormer med variable størrelser, selv blant ormer innenfor samme brønn. C. elegans er kjent for patogenunngåelse19, noe som kunne ha bidratt til den observerte variasjonen i størrelse og til slutt påvirke nedstrøms avbildningsormdeteksjon, spesielt. For å eliminere en slik variasjon ble hele NGM-området i hver brønn dekket av testbakterier. Videre ble ormer matet E. coli OP50 og fikk lov til å utvikle seg fullt ut til unge voksne i 48 timer ved 25 ° C. Å tillate ormer å nå voksen alder på E. coli OP50 før de overføres til testbakterier, resulterte i mer konsistent kroppsstørrelse. I tillegg ble overbefolkning og rask matutarming av avkom eliminert ved å supplere NGM-agar med FUDR. Implementeringen av FUDR fjernet avkom og forbedret automatisert ormeidentifikasjon, som ble skjult av avkom som blandet seg med foreldrepopulasjonen. Det er imidlertid viktig å være forsiktig og bruke passende kontroller ved bruk av FUDR, da forbindelsen er kjent for å påvirke C. elegans proteostase og levetid20,21. Under betingelsene beskrevet i denne protokollen påvirket FUDR ikke intestinal polyQ-aggregering (supplerende figur 5); Derfor var bruken egnet og gunstig for den beskrevne metoden.
Frysing av prøver før avbildning viste seg å være et kritisk skritt i den vellykkede ansettelsen av rørledningen. De aggregerte tellingene før frysing var signifikant høyere enn manuelle tellinger (figur 3B). Å holde ormer ved -20 °C i 18-48 timer før avbildning reduserte bakgrunnsfluorescens og forbedret til slutt aggregatdeteksjon (figur 3A). Effektene av frysing på aggregatdeteksjon er bare undersøkt for polyQ og bør ikke generaliseres til andre modeller uten ytterligere undersøkelser av slike effekter.
Til tross for at alle forholdene ble holdt de samme, ble det observert at gjennomsnittlig antall aggregater per orm kunne variere mellom forskjellige løp, mens forholdet mellom antall aggregater i dyr kolonisert med OP50 versus MPAO1 forble konsistent (figur 6, supplerende figur 2, supplerende figur 5). Derfor er det viktig å alltid inkludere E. coli OP50-kontroll, eller eventuelle ekstra passende referansekontroller, i hver kjøring. Slik variasjon i aggregerte tellinger mellom eksperimenter kan påvirkes av miljøforhold (temperatur, fuktighet)22,23 eller genetisk bakgrunn8. Faktisk ble det observert at etter langvarig kultur ble tarmfluorescens drastisk redusert eller helt tapt, noe som krevde tining av en ny stamme fra frossen bestand. Den observerte reduksjonen i fluorescens kan være et resultat av genetiske endringer som undertrykker giftige transgener, slik som de som uttrykker polyQ. Ikke desto mindre understreker den eksepsjonelle reproduserbarheten av resultatene observert mellom forskjellige eksperimenter (supplerende figur 2), mellom biologiske replikasjoner (figur 5) og innenfor samme prøve (supplerende figur 3) styrken av denne tilnærmingen.
Tallrike rapporter har brukt intestinal polyQ for å studere proteostase 9,11,12,13,24,25. En direkte sammenligning mellom resultatene kan imidlertid ikke gjøres på grunn av variasjon mellom eksperimentelle tilnærminger og avlesningsmetoder. Ikke desto mindre er noen få resultater fra tidligere publiserte data rekapitulert av den automatiserte kvantifiseringen som er beskrevet her, inkludert bakteriell induksjon av aggregering 9,13 og et sammenlignbart antall aggregater11. Samlet gir den beskrevne rørledningen et verdifullt verktøy for å studere proteostase.
Metoden beskrevet her har noen iboende utfordringer. For eksempel krever det tilstrekkelig tid til å mestre alle komponentene i denne protokollen, noe som spesielt gjelder for seksjon 8 i protokollen, som krever kjennskap til analysen for å avgjøre om bildene som er anskaffet, er passende for rørledningsanalyse. Avvik fra bildeinnhentingsinnstillingene som brukes i denne protokollen er mulige; Imidlertid vil det sannsynligvis være nødvendig med endring av innstillingene og ormtreningssettet. Denne rørledningen kan skille aggregater av forskjellige størrelser og de som berører, noe som begrenser “blanding” av aggregater og til slutt øker deteksjonsfølsomheten. Det kan imidlertid oppstå problemer når man forsøker å identifisere store aggregater som overskrider det aksepterte størrelsesområdet, da utvidelse av terskelen for øvre størrelse kan føre til feil forårsaket av dårlig identifikasjon, for eksempel manglende evne til å skille aggregater som berører. En balanse mellom nøyaktighet, størrelse og intensitet må finnes før bildeanalyse. Effektiviteten av samlet identifikasjon kan forbedres ytterligere ved å inkorporere maskinlæring for å skape et nevralt nettverk som er i stand til å forbedre aggregatdeteksjon. Slike forbedringer blir for tiden utforsket og vil i stor grad hjelpe til med å løse aktuelle problemer som påvisning av aggregater som ligger på forskjellige fokalplan eller som har unormale former.
En bemerkelsesverdig svakhet ved den beskrevne metoden er variasjonen i automatiserte aggregattellinger, da de ikke alltid rekapituleres ved manuelle tellinger i ormer som mates forskjellige bakteriestammer. For eksempel, basert på automatiserte tellinger, hadde ormer matet P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant færre aggregater sammenlignet med villtypestammen (MPAO1) (figur 7); Bekreftelsen av treffet viste imidlertid ingen signifikant forskjell (supplerende figur 4). Generelt har narkotikaskjermer med høy gjennomstrømning en høy grad av falsk positiv treffdeteksjon, og den beskrevne metoden er ikke noe unntak26. Dermed er det en kritisk del av protokollen å bekrefte alle potensielle treff.
Mens denne protokollen ble optimalisert for å passe til en screeningstrategi for å identifisere bakterier som påvirker vertsproteostase, kan hvert trinn modifiseres ytterligere for å teste effekten av genomiske RNAi-biblioteker, små molekyler eller andre forhold. Ytterligere modifikasjoner kan gjøres på hvert trinn for å dekke kravene til en bestemt screeningstrategi. Videre gir denne teknikken et nivå av fleksibilitet som gjør det mulig å optimalisere hvert trinn for å passe til en bestemt modell. For eksempel kan denne tilnærmingen utvides til polyQ-aggregering i andre vev eller ekstrahere andre funksjoner oppdaget i bilder som overvåking av genuttrykk ved hjelp av induserbare fluorescerende reportere (f.eks. Varmesjokkgener), vurdere subcellulær lokalisering av proteiner (f.eks. Nukleær lokalisering av DAF-16), studere aggregering i andre sykdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuclein, TDP-43, etc.) eller vurdere fysiologiske fenotyper, for eksempel ormstørrelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) og Infectious Diseases Society of America finansiering til DMC. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet. Vi takker medlemmene av Czyz Lab for korrekturlesing av manuskriptet. Tegneseriefigurer ble generert ved hjelp av BioRender betalt lisens.
1.7 mL Microtubes | Olympus Plastics | Cat#24-282 | Microcentrifuge tubes |
10 mL Serological Pipettes | GenClone | Cat#12-104 | Plastic pipettes |
15 mL Centrifuge Tubes, Racked | Olympus Plastics | Cat#28-101 | Conical tubes |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Genesee Scientific | 91-600RB | Pipette gun |
Agar | Fisher Scientific | Cat#BP1423-2 | Granulated agar |
BioRender | BioRender | Graphical figure generator | |
Bleach (Regular) | Clorox | Bar# 044600324111, Splash-less Bleach | 4.5% sodium hypochlorite |
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM140, Q35::YFP | Muscle polyQ |
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM738, Q44::YFP | Intestinal polyQ |
CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | Cat#C79-500 | Calcium chloride dihydrate |
CellProfiler | Broad Institute | Image analysis software | |
Cholesterol | Fisher Scientific | Cat#ICN10138201 | Cholesterol |
Circulating Water Bath Head | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO | CoolLED | 8114931 | Fluorescent light control and emitter |
16 mL Culture Tubes | Olympus Plastics | 21-129 | Culture tubes, 17 mm x 100 mm |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | E. coli control strain |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen | Leica Microsystems | 10450910 | Eyepiece set |
Filter Set ET GFP – MZ10F | Leica Microsystems | 10450588 | Filter cube |
GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | Statistical analysis tool | |
Heratherm Incubator IMP180 | Thermo | 51031562 | Refrigerated incubator |
Innova 4000 | New Brunswick Scientific | M1192-0000 | Shaking incubator |
K5 Camera | Leica Microsystems | 11547112 | Stereomicroscope camera |
KH2P04 | Fisher Scientific | Cat#P285-3 | Potassium phosphate monobasic |
LAS X Imaging Software | Leica Microsystems | Microscope imaging software | |
Leica MZ10 F Optics Carrier | Leica Microsystems | 10450103 | Stereomicroscope |
Levamisole | Fisher Scientific | Cat#0215522805 | Levamisole hydrochloride |
Luria Broth (Lennox) | Apex Bioresearch Products | Cat#11-125 | LB |
Magnetic Stir Plate | Fisher Scientific | 11-100-49S | Stir plate |
MgSO4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | Magnesium sulfate heptahydrate |
Microscope Slides | Premiere | 8205 | Single frosted microscope slides |
Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | Cat#S373-500 | Sodium phosphate dibasic heptahydrate |
NaCl | Fisher Scientific | Cat#S671-500 | Sodium chloride |
NaOH | Fisher Scientific | Cat#S318-3 | Sodium hydroxide pellets |
Objective Achromat, f = 100 mm | Leica Microsystems | 10411597 | Objective microscope lens |
Petri Dishes | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm x 15 mm |
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library | Manoil Lab (University of Washington) | P. aeruginosa mutant library | |
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-102 | Used for worm growth and imaging |
Trinocular Tube 100% M-series | Leica Microsystems | 10450043 | |
Trypticase Peptone | ThermoFisher, Difco | Cat#211921 | |
TX-400 Rotor | Thermo Scientific | Cat#75003181 | Swing bucket rotor |
Vacuum Driven Filter System | GenClone | Cat#25-227 | 500 mL, PES Membrane, .22 µm |
Video Objective with C-Mount | Leica Microsystems | 10447367 | 0.63x camera adapter tube |