माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस ऊतक के संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमेटिक पृथक्करण
Summary
यह तंत्रिका कोशिका पृथक्करण प्रोटोकॉल शुरुआती सामग्री की कम मात्रा के साथ नमूनों के लिए अभिप्रेत है और वैकल्पिक निर्धारण और धुंधला चरणों के साथ डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक अत्यधिक व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है।
Abstract
यह तंत्रिका पृथक्करण प्रोटोकॉल (एक वाणिज्यिक वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट के साथ प्रोटोकॉल का एक अनुकूलन) प्रवाह साइटोमेट्री या एकल-सेल अनुक्रमण जैसे विस्तृत डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की तैयारी में ऊतक प्रसंस्करण को अनुकूलित करता है। तंत्रिका पृथक्करण को यांत्रिक पृथक्करण के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है (जैसे कि फिल्टर, चॉपिंग तकनीक, या पिपेट ट्रिचुरेशन का उपयोग करना), एंजाइमेटिक पाचन, या उसके संयोजन। न्यूरोनल कोशिकाओं की नाजुक प्रकृति न्यूनतम सेलुलर मलबे के साथ अत्यधिक व्यवहार्य, सच्चे एकल-सेल निलंबन को प्राप्त करने के प्रयासों को जटिल कर सकती है जो एकल-सेल विश्लेषण के लिए आवश्यक है। डेटा से पता चलता है कि स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन का यह संयोजन लगातार एक अत्यधिक व्यवहार्य (>90%) एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है, जो उपर्युक्त कठिनाइयों पर काबू पाता है। जबकि कुछ चरणों को मैन्युअल निपुणता की आवश्यकता होती है, ये चरण नमूना हैंडलिंग और संभावित सेल हानि को कम करते हैं। यह पांडुलिपि अन्य प्रयोगशालाओं को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की तैयारी में तंत्रिका ऊतक की छोटी मात्रा को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सुसज्जित करने के लिए प्रक्रिया के प्रत्येक चरण का विवरण देती है।
Introduction
हिप्पोकैम्पस को पहली बार एक बोलोग्नीज एनाटॉमिस्ट, Giulio Cesare Aranzio द्वारा 1500 के दशक में वर्णित किया गयाथा। इस नई संरचना के नामकरण में, Aranzio संभवतः जीनस हिप्पोकैम्पस1 के seahorse के लिए अपनी अलौकिक समानता से प्रेरित था। हिप्पोकैम्पस तनाव प्रतिक्रियाओं में शामिल है, लेकिन व्यापक रूप से सीखने और स्मृति में अपनी भूमिका के लिए जाना जाता है। अधिक विशेष रूप से, हिप्पोकैम्पस घोषणात्मक और स्थानिक स्मृति1 के एन्कोडिंग और पुनर्प्राप्ति के लिए जिम्मेदार है।
हिप्पोकैम्पस, या हिप्पोकैम्पस उचित, CA1 (cornu ammonis), CA2, और CA3 subfields1 में विभाजित है। तंत्रिका तंत्र के बाकी हिस्सों की तुलना में, हिप्पोकैम्पस में कई अद्वितीय परिभाषित विशेषताएं हैं, जिनमें इसकी प्लास्टिसिटी और चल रहे न्यूरोजेनेसिस 2 के लिए क्षमता शामिलहै। न्यूरोजेनेसिस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव की प्रक्रिया है, जिसके बाद पहले से मौजूद न्यूरोनल नेटवर्क में उनका एकीकरण होता है। न्यूरोजेनेसिस डेंटेट गाइरस और पार्श्व वेंट्रिकल्स (और घ्राण बल्ब) के सबवेंट्रिकुलर क्षेत्र के उप-ग्रेन्युलर क्षेत्र तक सीमित है। जबकि न्यूरोजेनेसिस भ्रूणजनन में प्रचुर मात्रा में है, यह एक आजीवन प्रक्रियाहै 3,4। जैसे, यह चर्चा हिप्पोकैम्पस में वयस्क न्यूरोजेनेसिस पर ध्यान केंद्रित करेगी।
सबवेंट्रिकुलर और सबग्रेन्युलर ज़ोन न्यूरोजेनिक niches होते हैं जिनमें ependymal और संवहनी कोशिकाएं होती हैं, साथ ही तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अपरिपक्व और परिपक्व वंशहोते हैं। माइक्रोग्लिया न्यूरोजेनेसिस 6 को विनियमित करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में इन niches में योगदान देताहै। तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के नॉनस्टेम सेल संतान हैं। सबवेंट्रिकुलर ज़ोन में तीन प्रकार के तंत्रिका पूर्वज मौजूद होते हैं: रेडियल ग्लिया-जैसे टाइप बी कोशिकाएं, टाइप सी ट्रांजिट-एम्प्लिफाइंग पूर्वज, और टाइप ए न्यूरोब्लास्ट्स 3,8। सबवेंट्रिकुलर ज़ोन में धीरे-धीरे विभाजित प्रकार बी तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं तेजी से विभाजित टाइप सी कोशिकाओं में अंतर कर सकतीहैं। इसके बाद, टाइप सी कोशिकाएं टाइप ए कोशिकाओं8 में अंतर करती हैं। ये न्यूरोब्लास्ट्स रोस्ट्रल प्रवासी धारा के माध्यम से घ्राण बल्ब में स्थानांतरित हो जाते हैं, इससे पहले कि इंटरन्यूरॉन्स या ओलिगोडेंड्रोसाइट्स 9 में अंतरकिया जा सके। ये घ्राण बल्ब इंटरन्यूरॉन्स घ्राण अल्पकालिक स्मृति, और साहचर्य सीखने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जबकि ओलिगोडेंड्रोसाइट्स कॉर्पस कैलोसम9 के अक्षतंतुओं को माइलिनेट करते हैं। वयस्क न्यूरोजेनेसिस का बहुमत डेंटेट गाइरस के उप-ग्रेन्युलर क्षेत्र में होता है, जहां रेडियल टाइप 1 और नॉनरेडियल टाइप 2 तंत्रिका पूर्वज पाए जाते हैं। अधिकांश तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं डेंटेट ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स बनने के लिए नियत हैं। गैप जंक्शनों से जुड़े, एस्ट्रोसाइट्स प्लास्टिसिटी, सिनैप्टिक गतिविधि और न्यूरोनल उत्तेजना को संशोधित करने के लिए नेटवर्क बनातेहैं। Dentate gyrus के प्राथमिक उत्तेजक न्यूरॉन के रूप में, ग्रेन्युल कोशिकाएं CA3 क्षेत्र11 को एंटोरिनल कॉर्टेक्स से इनपुट प्रदान करती हैं।
तंत्रिका स्टेम सेल आबादी को इम्युनोमैग्नेटिक या इम्युनोफ्लोरोसेंट अलगाव रणनीतियों12,13 का उपयोग करके अलग किया जा सकता है। तंत्रिका ऊतक को अलग करना विशेष रूप से मुश्किल है; ऐसा करने के प्रयासों के परिणामस्वरूप अक्सर खराब सेल व्यवहार्यता वाले नमूने होते हैं और / या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक एकल-सेल निलंबन का उत्पादन करने में विफल रहते हैं। तंत्रिका पृथक्करण को यांत्रिक पृथक्करण के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है (जैसे कि फिल्टर, चॉपिंग तकनीक, या पिपेट ट्राइटुरेशन का उपयोग करना), एंजाइमेटिक पाचन, यातकनीकों का संयोजन 14,15। तंत्रिका पृथक्करण विधियों का मूल्यांकन करने वाले एक अध्ययन में, विभिन्न एंजाइमों के साथ पिपेट ट्राइटुरेशन और पाचन के संयोजन बनाम पिपेट ट्राइटुरेशन द्वारा मैनुअल यांत्रिकपृथक्करण की व्यवहार्यता और गुणवत्ता की तुलना की गई थी। गुणवत्ता को तैयार निलंबन15 में सेल clumps और डीएनए या उपकोशिकीय मलबे की मात्रा के आधार पर वर्गीकृत किया गया था। अकेले मैनुअल यांत्रिक पृथक्करण के अधीन ग्लियाल ट्यूमर के निलंबन में डिस्पेज़ के साथ उपचार या डीएनएस, कोलेजेनेस और हाइलूरोनिडेज़15 के संयोजन की तुलना में काफी कम सेल व्यवहार्यता थी। Volovitz et al. ने विभिन्न तरीकों के बीच व्यवहार्यता और गुणवत्ता में भिन्नता को स्वीकार किया और जोर देकर कहा कि अपर्याप्त पृथक्करण डाउनस्ट्रीम विश्लेषण15 की सटीकता को कम कर सकता है।
एक अलग अध्ययन में, लेखकों ने 60 से अधिक विभिन्न तरीकों और सुसंस्कृत न्यूरोनल कोशिकाओं के पृथक्करण केसंयोजनों की तुलना की। इन विधियों में पिपेट ट्राइटुरेशन द्वारा मैनुअल यांत्रिक पृथक्करण के आठ अलग-अलग रूप शामिल थे, तीन अलग-अलग अंतरालों पर पांच व्यक्तिगत एंजाइमों के साथ इनक्यूबेशन की तुलना, और एंजाइमेटिक पाचन या दो एंजाइमों के संयोजन के साथ यांत्रिक पृथक्करण के विभिन्न संयोजन14। यांत्रिक विधियों में से कोई भी एकल-सेल निलंबन14 उत्पन्न नहीं करता है। एकल एंजाइम उपचारों में से चार, संयोजन एंजाइमेटिक उपचारों में से दस, और एंजाइमेटिक पाचन के साथ यांत्रिक पृथक्करण के संयोजनों में से चार ने एकल-कोशिका निलंबन14 उत्पन्न किया। TrypLE के साथ एंजाइमेटिक पाचन ट्रिप्सिन-ईडीटीए के बाद सबसे प्रभावी ढंग से अलग किए गए नमूने14। संयोग से, TrypLE और / या ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ इलाज किए गए नमूने जिलेटिनस clumps14 बनाने के लिए प्रवृत्त होते हैं। जबकि यह अध्ययन सुसंस्कृत कोशिकाओं पर किया गया था, यह अकेले पिपेट ट्राइटुरेशन या एंजाइमेटिक पाचन की कमियों से बात करता है।
मैनुअल बनाम स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण की साइड-बाय-साइड तुलना की कमी है। हालांकि, एक समूह ने वाणिज्यिक पपेन या ट्रिप्सिन एंजाइमेटिक पृथक्करण किट16 के साथ संयोजन के रूप में पूरे माउस दिमाग के मैनुअल और अर्ध-स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण की तुलना करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री चलाया। पृथक्करणकर्ता के साथ प्रसंस्करण अधिक लगातार व्यवहार्य कोशिकाओं16 उपज. पृथक्करण के बाद, लेखकों ने प्रोमिनिन -1 कोशिकाओं, न्यूरोनल अग्रदूत कोशिकाओं और माइक्रोग्लिया16 को भी अलग कर दिया। तीन अलग-थलग सेल आबादी में से दो के लिए, अलग-थलग कोशिकाओं की शुद्धता थोड़ी अधिक थी जब नमूनों को मैन्युअल रूप से16 की तुलना में पृथक्करणकर्ता के साथ संसाधित किया गया था। Reiç et al. ने नोट किया कि पिपेटिंग तकनीक में व्यक्ति-से-व्यक्ति परिवर्तनशीलता ऊतक पृथक्करण16 में व्यवहार्य सेल जनसंख्या उपज की पुनरुत्पादकता में बाधा डालती है। लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण नमूना प्रसंस्करण16 को मानकीकृत करता है।
इस पांडुलिपि में उल्लिखित पृथक्करण की विधि पूरी तरह से स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन का एक संयोजन है, जो एक वाणिज्यिक वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट17 के साथ समाधान का उपयोग करता है। मानक प्रोटोकॉल के विपरीत, यह अनुकूलित प्रोटोकॉल नमूना हेरफेर को कम करता है, एक अत्यधिक व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है, और शुरुआती ऊतक की न्यूनतम मात्रा को संसाधित करने के लिए अभिप्रेत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तंत्रिका पृथक्करण प्रोटोकॉल में कई चरणों में कुशल तकनीक और निपुणता-परफ्यूजन, supernatant आकांक्षा, और माइलिन हटाने की आवश्यकता होती है। परफ्यूजन प्रक्रिया के दौरान, आंतरिक अंगों को बरकरार रहना चाहिए (डाय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Aimee रोजर्स को हाथों पर प्रशिक्षण और निरंतर उत्पाद समर्थन प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम चल रहे समस्या निवारण और स्पष्ट चर्चाओं के लिए डॉ अमांडा बर्क को धन्यवाद देते हैं। हम इस पांडुलिपि के व्याकरणिक संपादन और स्वरूपण के लिए मेरेडिथ जोहेम और यूएएमएस विज्ञान संचार समूह को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को NIH R25GM083247 और NIH 1R01CA258673 (A.R.A. ) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
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