마우스 뇌 해마 조직의 기계적 및 효소적 해리 결합
Summary
이 신경세포 해리 프로토콜은 출발 물질의 양이 적은 샘플을 대상으로 하며, 선택적 고정 및 염색 단계를 통해 다운스트림 분석을 위해 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
Abstract
이 신경 해리 프로토콜 (상용 성인 뇌 해리 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 적응)은 유세포 분석 또는 단일 세포 시퀀싱과 같은 상세한 하류 분석에 대비하여 조직 처리를 최적화합니다. 신경 해리는 기계적 해리 (예를 들어 필터, 베핑 기술 또는 피펫 분쇄 사용), 효소 소화 또는 이들의 조합을 통해 수행 될 수 있습니다. 신경 세포의 섬세한 특성은 단일 세포 분석에 필요한 최소한의 세포 파편으로 실행 가능하고 진정한 단일 세포 현탁액을 얻으려는 노력을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 데이터는 자동화 된 기계적 해리와 효소 소화의 이러한 조합이 일관되게 매우 실행 가능한 (>90 %)의 단일 세포 현탁액을 산출하여 앞서 언급 한 어려움을 극복한다는 것을 보여줍니다. 몇 가지 단계는 수동 손재주가 필요하지만 이러한 단계는 샘플 처리 및 잠재적 인 세포 손실을 줄입니다. 이 원고는 다운스트림 분석을 준비하기 위해 소량의 신경 조직을 성공적으로 해리시키기 위해 다른 실험실을 갖추는 과정의 각 단계를 자세히 설명합니다.
Introduction
해마는 볼로냐 해부학자 줄리오 체사레 아란지오(Giulio Cesare Aranzio)에 의해 1500년대1년에 처음 기술되었다. 이 새로 발견 된 구조물의 이름을 지을 때, Aranzio는 해 마1 속의 해마와 닮은 기묘한 유사성에서 영감을 얻었을 것입니다. 해마는 스트레스 반응에 관여하지만 학습과 기억에서의 역할로 널리 알려져 있습니다. 보다 구체적으로, 해마는 선언적 및 공간 기억(1)의 인코딩 및 검색을 담당한다.
해마 또는 해마는 CA1 (cornu ammonis), CA2 및 CA3 서브 필드1로 나뉩니다. 신경계의 나머지 부분과 비교할 때, 해마는 가소성과 진행중인 신경 발생의 잠재력을 포함하여 몇 가지 독특한 정의 특성을 가지고 있습니다2. 신경 발생은 신경 줄기 세포의 증식 및 분화의 과정이며, 그 다음에 기존의 신경 네트워크로의 통합이 뒤 따른다. 신경 발생은 치과 자이러스의 하위 과립 영역과 측심실 (및 후각 전구)의 심실 하부 영역으로 제한됩니다3. 신경 발생은 배아 발생에 풍부하지만, 평생 과정 3,4입니다. 따라서이 토론은 해마의 성인 신경 발생에 초점을 맞출 것입니다.
심실 하부 및 하위 과립 영역은 상피 및 혈관 세포뿐만 아니라 신경 줄기 세포의 미성숙하고 성숙한 혈통을 포함하는 신경 인성 틈새 시장입니다5. Microglia는 신경 생성을 조절하는 면역 세포로서 이러한 틈새 시장에 기여합니다6. 신경전구세포는 신경줄기세포의 비줄기세포 자손(7)이다. 세 가지 유형의 신경 선조가 심실 하부 영역에 존재합니다 : 방사형 신경교세포 유사 B 세포, C 형 전이 증폭 전구 인자 및 A 형 신경 세포 3,8. 심실 하부 영역에서 천천히 분열하는 B형 신경 전구 세포는 빠르게 분열하는 C형 세포(8)로 분화할 수 있다. 이어서, C형 세포는 A형 세포8로 분화한다. 이들 신경세포는 로스트랄 철새 스트림을 통해 후각 전구로 이동한 후 인터뉴런 또는 희소돌기아교세포(9)로 분화된다. 이러한 후각 전구 인터뉴런은 후각 단기 기억 및 연관 학습의 핵심인 반면, 올리고덴드로사이트는 코퍼스 캘로섬9의 축삭돌기를 수초로 한다. 성인 신경 발생의 대부분은 치과 자이러스의 하위 과립 영역에서 발생하며, 방사형 유형 1 및 비 방사형 유형 2 신경 선조가 발견됩니다3. 대부분의 신경 전구 세포는 상아질 과립 뉴런 및 성상세포(10)가 될 운명이다. 갭 접합에 의해 연결되어, 성상세포는 가소성, 시냅스 활성 및 신경 흥분성을 조절하기 위해 네트워크를 형성한다5. 치아질 자이러스의 일차 흥분성 뉴런으로서, 과립 세포는 엔토리날 피질로부터 CA3 영역(11)으로의 입력을 제공한다.
신경줄기세포 집단은 면역자기 또는 면역형광 분리 전략(12,13)을 사용하여 단리될 수 있다. 신경 조직은 특히 해리하기가 어렵습니다. 그렇게 하려는 노력은 종종 불량한 세포 생존율을 갖는 샘플을 초래하고/하거나 다운스트림 분석에 필요한 단일 세포 현탁액을 생성하는데 실패한다. 신경 해리는 기계적 해리 (예를 들어 필터, 베핑 기술 또는 피펫 분쇄 사용), 효소 소화 또는 기술14,15의 조합을 통해 수행 될 수 있습니다. 신경 해리 방법을 평가하는 연구에서, 피펫 분쇄에 의한 수동 기계적 해리의 생존 가능성과 품질을 피펫 분쇄 및 다양한 효소와의 소화의 조합과 비교하여15. 품질은 제조된 현탁액(15) 내의 세포 덩어리 및 DNA 또는 세포내 파편의 양에 기초하여 등급화되었다. 수동 기계적 해리를 단독으로 실시한 신경교암 종양의 현탁액은 디스파아제 또는 DNase, 콜라게나제 및 히알루로니다제15의 조합을 사용한 치료보다 현저히 낮은 세포 생존율을 가졌다. Volovitz 등은 상이한 방법들 사이의 생존력과 질의 변화를 인정하고, 부적절한 해리가 다운스트림 분석(15)의 정확성을 감소시킬 수 있다고 강조했다.
별도의 연구에서, 저자들은 배양 된 신경 세포의 해리의 60 가지 이상의 다른 방법과 조합을 비교했다14. 이들 방법에는 피펫 분쇄에 의한 수동 기계적 해리의 여덟 가지 변형, 세 가지 상이한 간격으로 다섯 개의 개별 효소와의 인큐베이션 비교, 효소 소화와의 기계적 해리의 다양한 조합 또는 두 효소의 조합14가 포함되었다. 기계적 방법 중 어느 것도 단일 세포 현탁액(14)을 산출하지 않았다. 단일 효소 처리 중 네 개, 열 개의 조합 효소 처리, 및 효소적 소화를 통한 기계적 해리의 조합 중 네 개는 단일 세포 현탁액14를 산출하였다. 트립LE를 사용한 효소적 소화에 이어 트립신-EDTA가 가장 효과적으로 해리된 샘플14. 덧붙이자면, 트립LE 및/또는 트립신-EDTA로 처리된 샘플은 젤라틴 덩어리(14)를 형성하는 경향이 있었다. 이 연구는 배양 된 세포에 대해 수행되었지만 피펫 분쇄 또는 효소 소화 단독의 단점을 말해줍니다.
수동 및 자동 기계적 해리의 나란히 비교는 부족합니다. 그러나, 한 그룹은 상업적 파파인 또는 트립신 효소적 해리 키트(16)와 함께 전체 마우스 뇌의 수동 및 반자동화된 기계적 해리를 비교하기 위해 유세포 분석기를 실행하였다. 해리제를 사용한 처리는 보다 일관되게 생존가능한 세포(16)를 산출하였다. 해리 후, 저자들은 또한 Prominin-1 세포, 신경 전구체 세포 및 microglia16을 분리했습니다. 세 개의 분리된 세포 집단 중 두 개의 경우, 샘플이 해리기로 처리되었을 때 분리된 세포의 순도는 수동16과 비교하여 약간 더 높았다. Reiß et al.은 피펫팅 기술의 사람 대 사람 변동성이 조직 해리16에서 실행 가능한 세포 집단 수율의 재현성을 방해한다고 지적했다. 저자들은 자동화된 기계적 해리가 샘플 처리(16)를 표준화한다고 결론지었다.
이 원고에 요약된 해리 방법은 상업적 성인 뇌 해리 키트(17)와 함께 제공되는 용액을 사용하여 완전 자동화된 기계적 해리 및 효소적 소화의 조합이다. 표준 프로토콜과 달리, 이 최적화된 프로토콜은 샘플 조작을 줄이고, 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성하며, 최소한의 시작 조직을 처리하기 위한 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 신경 해리 프로토콜의 몇 가지 단계는 능숙한 기술과 손재주 – 관류, 상청 흡인 및 미엘린 제거가 필요합니다. 관류 과정 전반에 걸쳐 내부 장기는 손상되지 않아야합니다 (횡격막을 제거하고 심장을 자르는 것 외에); 이것은 나비 바늘로 심장의 상부 챔버를 피하는 것을 포함합니다. 필요한 헤파린을 함유 한 식염수의 양은 다양하지만 심장에서 흐르는 투명한 유체는 과정이 완료되었음을 나타…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실습 교육과 지속적인 제품 지원을 제공해 주신 Aimee Rogers에게 감사드립니다. 지속적인 문제 해결과 명확한 토론에 대해 Amanda Burke 박사님께 감사드립니다. 이 원고의 문법적 편집 및 서식에 대해 Meredith Joheim과 UAMS Science Communication Group에 감사드립니다. 본 연구는 NIH R25GM083247 및 NIH 1R01CA258673 (ARA)에 의해 지원되었다.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
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