JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Высокопроизводительный инструментарий транскрипции Streptomyces для синтетической биологии и применения натуральных продуктов

Published: September 10, 2021
doi:
10.3791/63012
, , , ,
1Centre for Synthetic Biology and Innovation,South Kensington Campus, 2Department of Medicine,South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease,Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building,South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences,University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre,Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry,Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

Этот протокол подробно описывает усовершенствованный метод синтеза высоких выходов рекомбинантных белков из системы Streptomyces venezuelae безклеточной транскрипции-трансляции (TX-TL).

Abstract

Streptomyces spp. являются основным источником клинических антибиотиков и промышленных химикатов. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 является быстрорастущим штаммом и естественным производителем хлорамфеникола, жадомицина и пикромицина, что делает его привлекательным кандидатом в качестве шасси синтетической биологии следующего поколения. Поэтому генетические инструменты, которые ускоряют разработку S. venezuelae ATCC 10712, а также других моделей Streptomyces spp., очень желательны для разработки и открытия природных продуктов. С этой целью в этом протоколе предусмотрена специальная бесклетовая система S. venezuelae ATCC 10712, обеспечивающая высокоурожайную гетерологичную экспрессию генов с высоким G + C (%) Этот протокол подходит для мелкомасштабных (10-100 мкл) периодических реакций в формате пластин с 96 или 384 лунками, в то время как реакции потенциально масштабируемы. Бесклеточная система надежна и может достигать высоких выходов (~ 5-10 μ M) для ряда рекомбинантных белков в минимальной установке. Эта работа также включает в себя широкий набор плазмидных инструментов для измерения в режиме реального времени мРНК и синтеза белка, а также флуоресцентного окрашивания помеченных белков в геле. Этот протокол также может быть интегрирован с высокопроизводительными рабочими процессами характеристик экспрессии генов или изучением ферментных путей из генов с высоким G + C (%) присутствующих в геномах актиномицетов.

Introduction

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции (TX-TL) обеспечивают идеальную платформу прототипирования для синтетической биологии для реализации быстрых циклов проектирования-сборки-тестирования-обучения, концептуальной инженерной основы для синтетической биологии1. Кроме того, растет интерес к системам TX-TL для производства высокоценного рекомбинантного белка в среде с открытой реакцией2, например, для включения нестандартных аминокислот в конъюгаты антитело-лекарство3. В частности, TX-TL требует клеточного экстракта, плазмиды или линейной ДНК и энергетического раствора для катализа синтеза белка в периодических или полунепрерывных реакциях. В то время как Escherichia coli TX-TL является доминирующей бесклеточной системой, ряд новых немодельных систем TX-TL привлекли внимание для различных применений4,5,6,7,8. Ключевые преимущества TX-TL включают гибкую масштабируемость (нанолитр на литр) 9,10, высокую воспроизводимость и автоматизированные рабочие процессы8,11,12. В частности, автоматизация TX-TL позволяет ускорить характеристику генетических частей и регуляторных элементов8,12,13.

С точки зрения реакционной установки, TX-TL требует как первичных, так и вторичных источников энергии, а также аминокислот, кофакторов, добавок и шаблонной последовательности ДНК. Нуклеотидные трифосфаты (NTP) обеспечивают первичный источник энергии для управления исходной мРНК (ATP, GTP, CTP и UTP) и синтеза белка (только ATP и GTP). Для увеличения выхода TX-TL NTP регенерируются за счет катаболизма вторичного источника энергии, такого как мальтоза14, мальтодекстрин15, глюкоза14, 3-фосфоглицерат (3-PGA)16, фосфоэнолпируват17 и L-глутамат18. Эта присущая метаболическая активность удивительно универсальна, но плохо изучена, особенно в новых системах TX-TL. Каждый источник энергии обладает особыми свойствами и преимуществами с точки зрения выхода АТФ, химической стабильности и стоимости, что является важным фактором для масштабирования реакций TX-TL. До сих пор современные протоколы для E. coli TX-TL достигли до 4,0 мг / мл (~ 157 мкМ) для модели зеленого флуоресцентного белка (GFP), используя смесь 3-PGA (30 мМ), мальтодекстрина (60 мМ) и D-рибозы (30 мМ) в качестве вторичного источника энергии19.

В последнее время наблюдается рост интереса к изучению вторичных биосинтетических путей метаболитов в системах TX-TL20,21,22. В частности, актинобактерии являются основным источником вторичных метаболитов, включая антибиотики и сельскохозяйственные химикаты23,24. Их геномы обогащены так называемыми биосинтетическими кластерами генов (BGC), которые кодируют ферментативные пути для вторичного биосинтеза метаболитов. Для изучения генетических частей актинобактерий и биосинтетических путей недавно был разработан ряд систем TX-TL на основе Streptomyces 5,6,25,26. Эти специализированные системы Streptomyces TX-TL потенциально полезны по следующим причинам: [1] обеспечение нативной белковой складной среды для ферментов из Streptomyces spp.26; [2] доступ к оптимальному пулу тРНК для высокой экспрессии генов G+C (%); [3] активный первичный метаболизм, который потенциально может быть захвачен для поставки биосинтетических прекурсоров; и [4] обеспечение ферментами, прекурсорами или кофакторами из вторичного метаболизма, присутствующего в экстракте нативной клетки. Таким образом, недавно был создан высокопроизводительный инструментарий S.venezuelae TX-TL для использования этих уникальных возможностей5.

Streptomyces venezuelae является новым хозяином для синтетической биологии с богатой историей в промышленной биотехнологии5,27,28,29 и в качестве модельной системы для изучения деления клеток и генетической регуляции у Actinobacteria30,31,32. Штамм основного типа, S. venezuelae ATCC 10712, имеет относительно большой геном 8,22 Мб с содержанием 72,5% G + C (%) (номер присоединения: CP029197), который кодирует 7377 кодирующих последовательностей, 21 рРНК, 67 тРНК и 30 биосинтетических кластеров генов27. В синтетической биологии S. venezuelae ATCC 10712 является привлекательным шасси для гетерологичной экспрессии биосинтетических путей. В отличие от большинства других пятен Streptomyces, он обеспечивает несколько ключевых преимуществ, включая быстрое время удвоения (~ 40 мин), широкий спектр генетических и экспериментальных инструментов5,28, отсутствие слипания мицелия и споруляцию в жидких средах28,33. Несколько исследований также продемонстрировали использование S. venezuelae для гетерологичной продукции разнообразного массива вторичных метаболитов, включая поликетиды, рибосомные и нерибосомальные пептиды34,35,36,37,38. Эти комбинированные особенности делают этот штамм привлекательным микробным хозяином для применения в синтетической биологии и метаболической инженерии. Хотя S. venezuelae не является доминирующей моделью Streptomyces для гетерологичной экспрессии генов, с дальнейшим развитием она подготовлена к более широкому использованию в поисках натуральных продуктов.

В этой рукописи представлен подробный протокол (рисунок 1) для высокопроизводительной системы S. venezuelae TX-TL, который был обновлен по сравнению с оригинальным ранее опубликованным протоколом26. В этой работе энергетический раствор и условия реакции были оптимизированы для увеличения выхода белка до 260 мкг/мл для белка-репортера mScarlet-I в периодической реакции продолжительностью 4 ч 10 мкл с использованием стандартной плазмиды pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Эта плазмида была специально разработана для обеспечения различных методов обнаружения экспрессии белка. Протокол также оптимизирован, в то время как энергетическая система была оптимизирована для снижения сложности и стоимости настройки бесклеточных реакций без ущерба для производительности. Наряду с оптимизированной системой TX-TL, была разработана библиотека генетических частей для тонкой настройки экспрессии генов и в качестве флуоресцентных инструментов для мониторинга TX-TL в режиме реального времени, тем самым создавая универсальную платформу для прототипирования экспрессии генов и биосинтетических путей естественного продукта из Streptomyces spp. и связанных с ним актинобактерий.

В этой работе рекомендуемая стандартная плазмида (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) может быть использована для создания рабочего процесса S. venezuelae TX-TL в новой лаборатории и доступна на AddGene (см. Дополнительную таблицу S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I предоставляет пользователю гибкость для изучения других кадров с открытым считыванием (ORF). mScarlet-I ORF оптимизирован кодон-оптимизирован для экспрессии гена S. venezuelae. Промоутер SP44 является сильным конститутивным промотором, который очень активен как в E. coli, так и в Streptomyces spp.39. Плазмида имеет два уникальных участка фермента рестрикции (NdeI, BamHI), чтобы обеспечить субклонирование новых ORF в рамке с помощью совместной C-концевой FLAG-метки и флуоресцеиновой мышьяковой шпильки (FlAsH) системы меток связующего. Альтернативно, оба тега могут быть удалены с включением стоп-кодона после субклонирования нового гена. С помощью этого базового вектора была продемонстрирована высокая экспрессия ряда белков, а именно белков из пути биосинтеза окситетрациклина и неохарактеризованной нерибосомальной пептидной синтетазы (NRPS) из Streptomyces rimosus (рисунок 2). С точки зрения обнаружения мРНК, стандартная плазмида pTU1-A-SP44-mScarlet-I содержит аптамер dBroccoli (в 3′-нетранслируемой области) для обнаружения с помощью зонда 3,5-дифтор-4-гидроксибензилиден имидазолинон (DFHBI). Для повышения гибкости на AddGene также был доступен набор инструментов для EcoFlex40-совместимых деталей MoClo, включая EcoFlex-совместимый вектор Streptomyces (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) и ряд вариантов плазмид pTU1-A-SP44, экспрессирующих суперпапковый зеленый флуоресцентный белок (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I и β-глюкуронидазу (GUS). В частности, плазмида pSF1C-A получена из pAV-gapdh28 и отверждается из сайтов BsaI/BsmBI для сборки MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP эквивалентен pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP от EcoFlex40, но содержит дополнительные функциональные возможности для сопряжения и хромосомной интеграции в Streptomyces spp. с использованием системы интегразы phiC3128.

Первый этап протокола включает в себя рост S. venezuelae ATCC 10712 или близкородственного штамма, сбор клеток в средней экспоненциальной фазе, этапы промывки клеток и уравновешивание в буферах S30A и S30B. Этот этап занимает три дня, и время для роста клеток может быть использовано для подготовки оставшихся компонентов, как описано ниже. Собранные клетки затем лизируются ультразвуком, осветляются и подвергаются реакции стока. На этом заключительном этапе подготовки клеточные экстракты могут быть подготовлены для длительного хранения при -80 °C, чтобы свести к минимуму потерю активности. Для сборки реакций TX-TL с использованием этого протокола представлен Streptomyces Master Mix (SMM) с опцией формата Minimal Energy Solution (MES), который дает сопоставимые выходы. Кроме того, рекомендуется нанести свежую культуру S. venezuelae ATCC 10712 из запаса глицерина -80 °C на пластину агара GYM и инкубировать при 28 °C в течение не менее 48-72 ч, пока не будут видны отдельные колонии. Только свежие культуры следует использовать для следующих шагов.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 1 и Таблицу 2 рецептов для средней и агаровой пластины GYM и буферов для мытья S30A и S30B. 1. Подготовка решений и общее руководство Храните все растворы, клетки (после роста) и клеточные экстракты на льду после приготовления, если н?…

Representative Results

Этот подробный протокол приведен в качестве примера, чтобы помочь пользователю установить систему Streptomyces TX-TL на основе штамма модели S. venezuelae ATCC 10712 (рисунок 1). Пользователь может стремиться изучить другие штаммы Streptomyces; однако этапы роста/сбора урожая дру?…

Discussion

В этой рукописи был описан высокопроизводительный протокол S. venezuelae TX-TL с подробными шагами, которые легко провести как для опытных, так и для новых пользователей систем TX-TL. Несколько функций из существующих протоколов Streptomyces45 и E. coli TX-TL41 были удалены, чтобы у?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы отметить следующую исследовательскую поддержку: EPSRC [EP/K038648/1] для SJM в качестве PDRA с PSF; Wellcome Trust спонсировал стипендию ISSF для SJM с PSF в Имперском колледже Лондона; Исследовательский грант Королевского общества [RGS\R1\191186]; Награда Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] для SJM в Кентском университете; и стипендия Фонда исследований глобальных проблем (GCRF) для KC в Кентском университете.

Materials

2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% – HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -. Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production–a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL – a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Tags

Keywords: Streptomyces VenezuelaeCell-free Transcription-translationHigh GC ContentMetabolic EnzymesBiosynthetic PathwaysHeterologous ExpressionS30A BufferS30B BufferDithiothreitol (DTT)SonicationCrude ExtractsNon-model OrganismSynthetic BiologyNatural Product Applications
check_url/63012?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image