Denne protokol beskriver en forbedret metode til syntetisering af høje udbytter af rekombinante proteiner fra en Streptomyces venezuelae cellefri transskription-oversættelse (TX-TL) system.
Streptomyces spp. er en vigtig kilde til klinisk antibiotika og industrielle kemikalier. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 er en hurtigt voksende stamme og en naturlig producent af chloramphenicol, jadomycin og pikromycin, hvilket gør det til en attraktiv kandidat som en næste generations syntetisk biologi chassis. Derfor er genetiske værktøjer, der fremskynder udviklingen af S. venezuelae ATCC 10712, samt andre Streptomyces spp. modeller, meget ønskelige for naturprodukt engineering og opdagelse. Med henblik herpå er et dedikeret S. venezuelae ATCC 10712 cellefrit system angivet i denne protokol for at muliggøre højtydende heterologt udtryk for høje G + C (%) gener. Denne protokol er velegnet til små (10-100 μL) batchreaktioner i enten 96-brønd eller 384-brønd pladeformat, mens reaktioner er potentielt skalerbare. Det cellefrie system er robust og kan opnå høje udbytter (~ 5-10 μ M) for en række rekombinante proteiner i en minimal opsætning. Dette arbejde indeholder også en bred plasmid værktøjssæt til real-time måling af mRNA og proteinsyntese, samt in-gel fluorescens farvning af mærkede proteiner. Denne protokol kan også integreres med high-throughput genekspression karakterisering arbejdsgange eller studiet af enzym veje fra høje G + C (%) gener til stede i Actinomycetes genomer.
Cellefri transskription-oversættelse (TX-TL) systemer giver en ideel prototypeplatform for syntetisk biologi til at gennemføre hurtige design-build-test-learn cykler, den konceptuelle tekniske ramme for syntetisk biologi1. Derudover er der stigende interesse for TX-TL-systemer for rekombinant proteinproduktion af høj værdi i et åbent reaktionsmiljø2, for eksempel at indarbejde ikke-standardiserede aminosyrer i antistof-lægemiddelkonjugerer3. Specifikt kræver TX-TL et celleekstrakt, plasmid eller lineært DNA og en energiopløsning til katalysereproteinsyntese i batch- eller halvkontinentale reaktioner. Mens Escherichia coli TX-TL er det dominerende cellefrie system, har en række nye ikke-model TX-TL-systemer tiltrukket sig opmærksomhed til forskellige applikationer4,5,6,7,8. De vigtigste fordele ved TX-TL omfatter fleksibel skalerbarhed (nanoliter til liter skala)9,10, stærk reproducerbarhed og automatiserede arbejdsgange8,11,12. Automatisering af TX-TL muliggør især accelereret karakterisering af genetiske dele og regulatoriske elementer8,12,13.
Med hensyn til reaktion setup, TX-TL kræver både primære og sekundære energikilder, samt aminosyrer, cofaktorer, tilsætningsstoffer, og en skabelon DNA-sekvens. Nukleotid triphosphater (NTPs) giver den primære energikilde til at drive indledende mRNA (ATP, GTP, CTP, og UTP) og proteinsyntese (kun ATP og GTP). For at øge TX-TL udbytter, ntps regenereres gennem katabolisme af en sekundær energikilde, såsom maltose14, maltodextrin15, glukose14, 3-fosfoglycerat (3-PGA)16, fosfoenolpyruvat17, og L-glutamat18. Denne iboende metaboliske aktivitet er overraskende alsidig, men dårligt undersøgt, især i nye TX-TL-systemer. Hver energikilde har forskellige egenskaber og fordele med hensyn til ATP-udbytte, kemisk stabilitet og omkostninger, hvilket er en vigtig overvejelse for opskalerede TX-TL-reaktioner. Indtil videre har de nuværende protokoller for E. coli TX-TL nået op til 4,0 mg/mL (~157 μM) for modellen grønt fluorescerende protein (GFP), ved hjælp af en blanding af 3-PGA (30 mM), maltodextrin (60 mM) og D-ribose (30 mM) som den sekundære energikilde19.
For nylig har der været en stigende interesse for at studere sekundære metabolitbiosyntetiske veje i TX-TL-systemer20,21,22. Specifikt er Actinobacteria en vigtig kilde til sekundære metabolitter, herunder antibiotika og landbrugskemikalier23,24. Deres genomer er beriget med såkaldte biosyntetiske genklynger (BGCs), som koder enzymatiske veje for sekundær metabolitbiosyntese. Til undersøgelse af Actinobacteria genetiske dele og biosyntetiske veje, en række Streptomyces-baserede TX-TL-systemer er for nylig blevet udviklet5,6,25,26. Disse specialiserede Streptomyces TX-TL-systemer er potentielt gavnlige af følgende grunde: [1] levering af et indfødt proteinfoldemiljø for enzymer fra Streptomyces spp.26; [2] adgang til en optimal tRNA-pulje til højt G+C (%) genekspression; [3] aktivt primært stofskifte, som potentielt kan kapres til levering af biosyntetiske prækursorer; og [4] levering af enzymer, prækursorer eller cofaktorer fra sekundær metabolisme til stede i den indfødte celle ekstrakt. Derfor er en højtydende S.venezuelae TX-TL værktøjskasse for nylig blevet etableret for at udnytte disse unikke kapaciteter5.
Streptomyces venezuelae er en spirende vært for syntetisk biologi med en rig historie inden for industriel bioteknologi5,27,28,29 og som et modelsystem til undersøgelse af celledeling og genetisk regulering i Actinobacteria30,31,32. Den vigtigste type stamme, S. venezuelae ATCC 10712, har et relativt stort genom på 8,22 Mb med 72,5% G + C indhold (%) (Tiltrædelsesnummer: CP029197), som koder 7377 kodning sekvenser, 21 rRNAs, 67 tRNAs, og 30 biosyntetiske gen klynger27. I syntetisk biologi er S. venezuelae ATCC 10712 et attraktivt chassis til det heterologe udtryk for biosyntetiske veje. I modsætning til de fleste andre Streptomyces pletter, det giver flere vigtige fordele, herunder en hurtig fordobling tid (~ 40 min), et omfattende udvalg af genetiske og eksperimentelle værktøjer5,28, mangel på mycelial klumpning, og sporulation i flydende medier28,33. Flere undersøgelser har også vist brugen af S. venezuelae til heterolog produktion af en bred vifte af sekundære metabolitter, herunder polyketider, ribosomale og nonribosomale peptider34,35,36,37,38. Disse kombinerede funktioner gør denne stamme til en attraktiv mikrobiel vært for syntetisk biologi og metaboliske tekniske applikationer. Mens S. venezuelae ikke er den dominerende Streptomyces model for heterologe genekspression, med yderligere udvikling, det er primet til bredere brug inden for naturlige produkt opdagelse.
Dette manuskript præsenterer en detaljeret protokol (figur 1) for et højtydende S. venezuelansk TX-TL-system, som er blevet opdateret fra den oprindelige tidligere offentliggjorte protokol26. I dette arbejde er energiopløsningen og reaktionsbetingelserne optimeret for at øge proteinudbyttet op til 260 μg/mL for mScarlet-I-reporterproteinet i en 4 timer, 10 μL batchreaktion ved hjælp af en standard plasmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Denne plasmid er specielt designet til at muliggøre forskellige metoder til påvisning af proteinudtryk. Protokollen er også strømlinet, mens energisystemet er blevet optimeret for at reducere kompleksiteten og omkostningerne ved at opsætte cellefrie reaktioner uden at gå på kompromis med udbyttet. Sammen med det optimerede TX-TL-system er der udviklet et bibliotek af genetiske dele til finjustering af genekspression og som fluorescerende værktøjer til overvågning af TX-TL i realtid og derved skabt en alsidig platform til prototype af genekspression og naturlige produktbiosyntetiske veje fra Streptomyces spp. og relaterede Actinobacteria.
I dette arbejde kan den anbefalede standard plasmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) bruges til at etablere S. venezuelae TX-TL-arbejdsgang i et nyt laboratorium og er tilgængelig på AddGene (se supplerende tabel S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I giver brugeren fleksibilitet til at studere andre åbne læserammer (ORF’er). MScarlet-I ORF er codon-optimeret til S. venezuelask genekspression. SP44 promotor er en stærk konstituerende promotor, der er meget aktiv i både E. coli og Streptomyces spp.39. Plasmid har to unikke begrænsning enzym sites (NDEI, BamHI) til at tillade sub-kloning af nye ORFs in-frame med en fælles C-terminal FLAG-tag og fluorescein arsenisk hårnål (FlAsH) bindemiddel tag system. Alternativt kan begge tags fjernes med inddragelse af en stop codon efter sub-kloning af et nyt gen. Med denne basevektor er det høje udbytte udtryk for en række proteiner blevet påvist, nemlig proteiner fra oxytetracyclin biosyntesevejen og en uhæmmet nonribosomal peptidsynetase (NRPS) fra Streptomyces rimosus (Figur 2). Med hensyn til mRNA-detektion indeholder pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid en dBroccoli aptamer (i 3′-uoversat region) til påvisning med 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinon (DFHBI) sonde. For øget fleksibilitet er der også stillet et værktøjssæt af EcoFlex40-kompatible MoClo-dele til rådighed på AddGene, herunder en EcoFlex-kompatibel Streptomyces shuttle vector (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) og en række pTU1-A-SP44 variant plasmider, der udtrykker superfolder grønt fluorescensprotein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I og β glucuronidase (GUS). Især pSF1C-A plasmid er afledt af pAV-gapdh28 og er helbredt for BsaI / BsmBI sites for MoClo samling. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP svarer til pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP fra EcoFlex40, men indeholder yderligere funktionalitet til bøjning og kromosomintegration i Streptomyces spp. ved hjælp af phiC31 integrase system28.
Den første fase af protokollen indebærer væksten af den s. venezuelanske ATCC 10712 eller en nært beslægtet stamme, cellehøst i midten af eksponentiel fase, cellevask trin, og ekvilibrering i S30A og S30B buffere. Denne fase kræver tre dage, og tiden for cellevækst kan bruges til at forberede de resterende komponenter som beskrevet nedenfor. De høstede celler lyser derefter ved sonikering, afklares og gennemgår en afstrømning. I denne sidste fase af forberedelsen kan celleekstrakterne forberedes til langtidsopbevaring ved -80 °C for at minimere tab af aktivitet. Til samling af TX-TL-reaktioner ved hjælp af denne protokol præsenteres en Streptomyces Master Mix (SMM) med mulighed for et MINIMAL Energy Solution-format (MES), der giver sammenlignelige udbytter. Desuden anbefales det at stribe en frisk kultur af S. venezuelae ATCC 10712 fra en -80 ° C glycerol lager på en GYM agar plade og inkubere ved 28 ° C i mindst 48-72 timer, indtil enkelte kolonier er synlige. Kun friske kulturer bør anvendes til følgende trin.
I dette manuskript er en højtydende S. venezuelae TX-TL-protokol blevet beskrevet med detaljerede trin, der er ligetil at udføre for både erfarne og nye brugere af TX-TL-systemer. Flere funktioner fra eksisterende Streptomyces45 og E. coli TX-TL41 protokoller er blevet fjernet for at etablere en minimal, men højtydende protokol for S. venezuelae TX-TL5,26. Den arbejdsgang, de…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende følgende forskningsstøtte: EPSRC [EP/K038648/1] for SJM som PDRA hos PSF; Wellcome Trust sponsoreret ISSF stipendium for SJM med PSF på Imperial College London; Royal Society forskningstilskud [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED-prisen [217528/Z/19/Z] for SJM ved University of Kent; og Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. stipendium til KC ved University of Kent.
2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
Equipment | |||
Platereader | BMG | Omega |