פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הידבקות מתגלגלת, הקלה על ידי אינטראקציות בתיווך סלקטיבי, היא תנועתיות דינמית מאוד, פסיבית בגיוס לויקוציטים לאתר של דלקת. תופעה זו מתרחשת venules postcapillary, שבו זרימת הדם דוחפת לויקוציטים בתנועה מתגלגלת על תאי האנדותל. גלגול יציב דורש איזון עדין בין היווצרות קשר הידבקות לבין הניתוק המכני שלהם, ומאפשר לתא להישאר מחובר לפני השטח תוך כדי גלגול לכיוון הזרימה. שלא כמו תהליכי הידבקות אחרים המתרחשים בסביבות סטטיות יחסית, הידבקות מתגלגלת היא דינמית מאוד כאשר התאים המתגלגלים נעים על פני אלפי מיקרון בעשרות מיקרון לשנייה. כתוצאה מכך, שיטות מכניות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה אינם מתאימים למדידת אירועי הידבקות בודדים ואת הכוחות המולקולריים הקשורים בשל ציר הזמן הקצר ורגישות גבוהה הנדרשים. כאן, אנו מתארים את היישום האחרון שלנו של טביעת הרגל הידבקות assay כדי לדמיין את P-selectin: אינטראקציות PSGL-1 בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. שיטה זו משתמשת רצועות מד מתח מבוססות DNA בלתי הפיכות כדי לייצר היסטוריה קבועה של אירועי הידבקות מולקולרית בצורה של מסלולי פלואורסצנטיות. ניתן לדמיין מסלולים אלה בשתי דרכים: (1) תפירת אלפי תמונות מוגבלות עקיפה כדי לייצר שדה ראייה גדול, המאפשרת הפקת טביעת רגל של הידבקות של כל תא מתגלגל לאורך אלפי מיקרון, (2) ביצוע DNA-PAINT כדי לשחזר תמונות ברזולוציית-על של מסלולי הפלואורסצנטיות בתוך שדה ראייה קטן. במחקר זה, נעשה שימוש ב-90% מטביעת הרגל של הידבקות כדי לחקור תאי HL-60 המתגלגלים בלחצי גיסה שונים. בעשותנו כן, הצלחנו לדמיין את ההתפלגות המרחבית של P-selectin: אינטראקציית PSGL-1 ולקבל תובנה על הכוחות המולקולריים שלהם באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות. לפיכך, שיטה זו מספקת את היסודות לחקירה כמותית של אינטראקציות פני התא השונות המעורבות בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית.
מבוא
מפל ההדבקה המתגלגל מתאר כיצד תאים במחזור לקשור ולהתגלגל לאורך קיר כלי הדם1. גלגול פסיבי הוא בעיקר בתיווך selectins, מחלקה עיקרית של מולקולות הידבקות הסלולר (CAMs)1. תחת זרם הגיזה של דם, לויקוציטים המבטאים P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1) יוצרים קשרים ארעיים מאוד עם P-selectin, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי על פני השטח של תאי אנדותל מודלקים. תהליך זה הוא קריטי עבור לויקוציטים לעבור לאתר של דלקת2. בנוסף, PSGL-1 הוא גם קולטן mechanosensitive מסוגל להפעיל את שלב הידבקות המשרד הבאים של מפל הידבקות מתגלגל על מעורבותו עם P-selectin3.
מוטציות גנטיות ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תיוג והיברידיה של אוליגונוקלאוטיד
- הפחתת קשרים דיסולפידים של חלבון G
- יש להמיס 10 מ"ג חלבון G (ProtG) ב-1 מ"ל של מים אולטרה-תותים.
הערה: החלבון G כאן משתנה עם שאריות ציסטאין בודדות בטרמינל C ותג פולי-היסטידין N-טרמינוס. - חילופי חוצצים ≥20 μL של ProtG (10 מ"ג /מ"ל) לתוך 1x PBS (pH 7.2) עם עמודת P6.
- מדוד את ריכוז החלבון לאחר חילופי חיץ.
הערה: ריכוז אופייני של 7-8 מ"ג/מ"ל. - הכן 120 mM טריס (2-קרבוקסיתיל)פוספין (TCEP) על ידי המסת 3 מ"ג TCEP לתוך 90 μL של 1x PBS (pH 7.2) ואחריו 10 μL של 0.5 M EDTA.
הערה: TCEP צריך להיות מוכן טרי. - הוסף 4 μL של 120 mM TCEP (480 נמול) ל 20 μL של ProtG (4-5 ....
- יש להמיס 10 מ"ג חלבון G (ProtG) ב-1 מ"ל של מים אולטרה-תותים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליך הניסיוני של תוחם טביעת הרגל של הידבקות. זרימת העבודה של הניסוי הכללי מודגמת באיור 1, החל מהרכבת תא הזרימה (איור 1A) וכלה בפונקציונליזציה של פני השטח (איור 1B) ושלבי הניסוי וההדמיה (איור 1C).
איור 2 הוא תוצאה מייצגת לאפיון הביו-שיתוף הביולוגי ProtG-ssDNA. הספקטרום UV/Vis של שלושה רכיבים במוצר הסופי, כלומר, ProtG, mal-s.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טביעת הרגל של הידבקות מאפשרת הדמיה של אירועי הידבקות מולקולרית בין PSGL-1 ו- P-selectin במהלך הידבקות מתגלגלת תאים. תהליך זה מופעל על ידי לכידה בתיווך P-selectin ואחריו מתגלגל תחת לחץ גיזום נוזלי. בעיות פוטנציאליות במהלך הניסוי כרוכות בדרך כלל גלגול תאים עניים או חסר מסלולי פלורסנט גם כאשר תאים מתגלגלים היטב. בעיות אלה נובעות לעתים קרובות מבקרי איכות בשלבים הקריטיים בפרוטוקול, כמפורט בטבלה לפתרון בעיות (טבלה 1).
ביומולקולס ומאגרים נדרשים להיות מסוננים ומאוחסנים ב 4 °C (4 °F) .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות (CFI 35492), המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה דיסקברי גרנט (RGPIN-2017-04407), גבולות חדשים בקרן המחקר (NFRFE-2018-00969), קרן מייקל סמית לחקר הבריאות (SCH-2020-0559) וקרן אמיליה הבריטית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מדריך מקדחה 4 ערוצים | בהתאמה אישית | עם שקופית נימה ABS | |
| 4 חורים | בהתאמה | מקדח שקופית מיקרוסקופ נקייה באמצעות דרמל עם מקדחים מצופים יהלום על מוביל מקדחה בעל 4 ערוצים בעל פריסה התואמת את מרכזי 8-32 חורי הברגה על מהדק האלומיניום. | |
| אצטון | VWR | BDH1101-4LP | |
| מרווח אקרילי | בהתאמה | חותכים שני בלוקים של יריעות אקריליות במידות של 40 מ"מ x 30 מ"מ x 2.5 מ"מ. בכל בלוק, קדחו שני חורים בקוטר 3 מ"מ המיושרים במדויק עם 4-40 החורים במחזיק האלומיניום. | |
| מחזיק שבבי אלומיניום | בהתאמה | בלוק אלומיניום אנודייז במכונה למחזיק בצורת C עם הממד החיצוני של 640 מ"מ x 500 מ"מ x 65 מ"מ וממד הפתיחה של 400 מ"מ x 380 מ"מ x 65 מ"מ. הכניסות והיציאות מקישות עם חוט 8-32. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| תמיסה אנטיביוטית/אנטי-פטרייתית | Cytiva HyClone | SV3007901 | עט/סטרפטוקוקוק/פטריות |
| חרוזים, פוליסטירן מצופה ProtG | Spherotech | PGP-60-5 | |
| אלבומין סרום בקר | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 מ"מ Tris, 75 מ"מ MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2 | ||
| Buffer, מתגלגל | HBSS עם 2 מ"מ CaCl2, 2 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ Hepes, 0.1% מאגר BSA | ||
| , שטיפה | 10 מ"מ Tris, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2 ו-2 מ"מ CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| סידן כלורי | VWR | BDH9224 | |
| צלוחיות תרבית תאים | VWR | 10062-868 | |
| חומצה גופרתית מרוכזת | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip מחזיק פינצטה | Techni-Tool | 758TW150 | |
| מקדחה מצופה יהלום ביטים | טכנולוגיית שוחקים | C5250510 | 0.75 מ"מ מקדח יהלום |
| DNA, אמין-ssDNA (גדיל עליון) | IDT DNA | מותאם אישית oligo | CCGGGCGACGCAGGGGGG / 3AmMO / |
| DNA, ביוטין-ssDNA (גדיל תחתון) | IDT DNA | מותאם אישית oligo | / 5BiotinTEG / TTTTT CCCTCCTGCGTCCCCGG |
| DNA, גדיל הדמיה עבור DNA-PAINT | IDT DNA | מותאם אישית oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, גדיל הדמיה לתיוג קבוע | IDT DNA | מותאם אישית oligo | CCGGGCGACGCAGG / 3Cy3Sp / |
| סרט דו צדדי | סקוטש | 237 | 3/4 אינץ 'רוחב, סרט דו צדדי קבוע |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| אפוקסי | גורילה | 42001 | זמן ריפוי 5 דקות |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| חומצה אצטית קרחונית | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| זכוכית, כיסויים | פישר סיינטיפיק | 12-548-5P | |
| זכוכית, שקופית מיקרוסקופ | VWR | 48300-026 | 75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ |
| זכוכית, צנצנת מכתים | VWR | 74830-150 | צנצנת צביעה וויטון (900620) |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| המוציטומטר | סיגמא-אולדריץ' | Z359629-1EA | |
| HL-60 תאים | ATCC | CCL-240 | |
| תמיכת שקופיות בתא לחות מודפס | בתלת מימד בהתאמה אישית | עם נימה ABS | |
| מי חמצן | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| אימידזול | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| כניסות/יציאות | מקדחה בהתאמה | דרך שמונה ברגים סטים של 8-32 באמצעות מקדחי קובלט. תוספת 1.5 ס"מ צינורות פוליאתילן (טיגון, תעודת זהות 1/32 אינץ' OD 3/32 אינץ') לתוך כל בורג חלול | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| מגנזיום כלוריד | VWR | BDH9244 | |
| חרוזי Ni-NTA מגנטיים | Invitrogen | 10103D | |
| צינורות דואר | EMS | EMS71406-10 | |
| מתנול | VWR | BDH1135-4LP | |
| מיקרו ביו-ספין P-6 עמודות ג'ל | Biorad | 7326200 | במאגר SSC |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-ביוטין | Laysan ביו | ביוטין-PEG-SVA-5000 | |
| אשלגן הידרוקסיד | VWR | 470302-132 | |
| חלבון, חלבון G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag ו-C-terminal |
| חלבון ציסטאין, P-selectin-Fc | R& D System | 137-PS | רקומביננטי חלבון כימרה אנושי P-Selectin/CD62P Fc, |
| חלבון CF, סטרפטווידין | ארז | CL1005-01-5MG | |
| מזרק משאבה | מכשיר הרווארד 704801 | ||
| מחלקת נתרן ביקרבונט | s Science | 470302-444 | |
| נתרן כלורי | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| מזרק | המילטון | 81520 | מזרקים עם נעילת PTFE, 5 מ"ל |
| מחטי מזרק | BD | 305115 | Precision Glide 26 גרם, אורך 5/8 אינץ' |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| צינורות, מתאם | Tygon | ABW00001 | ניסוח 3350, תעודת זהות 1/32 אינץ'; OD 3/32 אינץ' |
| צינורות, פוליאתילן | BD תוך-רפואי | 427406 | תוך-רפואי (PE20) 0.38 מ"מ; OD 1.09 מ"מ |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
מקורות
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Revie....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
