Et reporterbaseret cellulært assay til overvågning af splejsningseffektivitet
Summary
Denne protokol beskriver et minigen reporter-assay for at overvåge virkningen af 5′-splejsningsstedsmutationer på splejsning og udvikler suppressor U1 snRNA til redning af mutationsinduceret splejsningshæmning. Reporter- og suppressoren U1 snRNA-konstruktioner udtrykkes i HeLa-celler, og splejsning analyseres ved primerudvidelse eller RT-PCR.
Abstract
Under genekspression involverer det vitale trin i præ-mRNA-splejsning nøjagtig genkendelse af splejsningssteder og effektiv samling af splejsosomale komplekser til at forbinde exons og fjerne introner inden cytoplasmatisk eksport af det modne mRNA. Splejsningseffektivitet kan ændres ved tilstedeværelsen af mutationer på splejsningssteder, indflydelsen af transvirkende splejsningsfaktorer eller aktiviteten af terapi. Her beskriver vi protokollen for et cellulært assay, der kan anvendes til overvågning af splejsningseffektiviteten af en given exon. Assayet bruger en tilpasningsdygtig plasmidkodet 3-exon/2-intron minigen reporter, som kan udtrykkes i pattedyrceller ved forbigående transfektion. Efter transfektion isoleres totalt cellulært RNA, og effektiviteten af exon-splejsning i reporter-mRNA’et bestemmes ved enten primerudvidelse eller semikvantitær omvendt transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR). Vi beskriver, hvordan virkningen af sygdomsrelaterede 5 ′ splejsningsstedsmutationer kan bestemmes ved at introducere dem i reporteren; og hvordan undertrykkelsen af disse mutationer kan opnås ved co-transfektion med U1 lille nukleart RNA (snRNA) konstruktion, der bærer kompenserende mutationer i sin 5 ′ region, der baseparer med 5 ′-splejsningsstederne ved exon-intron-kryds i præ-mRNA’er. Reporteren kan således bruges til design af terapeutiske U1-partikler for at forbedre genkendelsen af mutante 5′ splejsningssteder. Indsættelse af cis-virkende reguleringssteder, såsom splejsningsforstærker eller lyddæmpersekvenser, i indberetteren kan også bruges til at undersøge U1 snRNP’s rolle i regulering formidlet af en specifik alternativ splejsningsfaktor. Endelig kan reporter, der udtrykker celler, inkuberes med små molekyler for at bestemme virkningen af potentielle terapier på konstitutiv præ-mRNA-splejsning eller på exoner, der bærer mutante 5 ′ splejsningssteder. Samlet set kan reporteranalysen anvendes til at overvåge splejsningseffektiviteten under en række forskellige forhold for at studere grundlæggende splejsningsmekanismer og splejsningsrelaterede sygdomme.
Introduction
Pre-mRNA-splejsning er et vigtigt behandlingstrin, der fjerner ikke-kodende introner og præcist ligerer kodende exoner til dannelse af modent mRNA. Genkendelse af konsensussekvenser ved exon-intron-kryds, kaldet 5′-splejsningssted og 3′-splejsningssted, ved hjælp af komponenter i splejsningsmaskineriet initierer splejsningsprocessen. U1 lille nukleart ribonukleoprotein (snRNP) genkender 5′-splejsningsstedet ved baseparring af U1-snRNA’et til præ-mRNA1. Genetisk arvelige mutationer, der ændrer 5′-splejsningsstedssekvenser, er forbundet med mange sygdomme2,3. Det forudsiges, at tabet af baseparring af U1 snRNA med de mutante 5′-splejsningssteder forårsager afvigende splejsning, hvilket kan kompromittere oversættelsen af det berørte transkript. En potentiel terapeutisk tilgang til at korrigere splejsningsdefekterne involverer undertrykkelse af mutationer ved modificeret U1-snRNA, der bærer kompenserende nukleotidændringer i dets 5′-region, der baseparer med 5′-splejsningsstedet. Sådanne modificerede U1-snRNA’er, også kaldet exonspecifikke U1-snRNA’er, har vist sig at være effektive til at vende splejsningsdefekter, hvilket resulterer i øget proteinekspression fra det reddede mRNA4,5,6,7,8.
Her beskriver vi U1 snRNP-komplementeringsassayet, et reporterbaseret cellulært splejsningsassay, der muliggør vurdering af effekten af 5′-ss-mutationer på splejsning af en exon og kan også bruges til udvikling af modificerede U1-snRNA’er for at muliggøre redning af exon-inklusion. Vi leverer også protokoller til overvågning af de splejsede reporterudskrifter ved primerudvidelse og RT-PCR og til bestemmelse af ekspressionen af modificerede U1-snRNA’er ved primerudvidelse og RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assayet kan tilpasses til splejsningsanalyse i andre cellelinjer end HeLa, men faktorer, der påvirker transfektionseffektiviteten, såsom cellesammenløb og mængde DNA, skal muligvis optimeres. Forholdet mellem reporter og U1-konstruktion er en anden kritisk parameter, der muligvis skal bestemmes afhængigt af de ekspressionsniveauer, der observeres i andre celletyper. Kvaliteten af ekstraheret RNA er kritisk for splejsningsanalyse; Derfor anbefales det stærkt at anvende RNase-frit vand og dekontaminering af overflade…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler til SS fra National Institutes of Health (R21CA170786 og R01GM127464) og American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) og til SS og W.M. fra Valley Research Partnership Program (P1-4009 og VRP77). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
