यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि लीफहॉपर वैक्टर द्वारा जारी लीफहॉपर और प्लांट वायरल प्रोटीन के लार प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्लांट होस्ट का उपयोग कैसे किया जाए।
कीट वैक्टर क्षैतिज रूप से कृषि महत्व के कई पौधों के वायरस को प्रसारित करते हैं। पौधों के आधे से अधिक वायरस हेमिप्टेरन कीड़ों द्वारा प्रेषित होते हैं जिनके मुंह में छेदने-चूसने वाले हिस्से होते हैं। वायरल संचरण के दौरान, कीट लार वायरस-वेक्टर-होस्ट को पुल करती है क्योंकि लार वैक्टर वायरस, और कीट प्रोटीन, पौधों के मेजबान में कीड़ों से पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर या दबाते हैं। लार प्रोटीन की पहचान और कार्यात्मक विश्लेषण आर्बोवायरस-होस्ट इंटरैक्शन के अनुसंधान क्षेत्र में फोकस का एक नया क्षेत्र बन रहे हैं। यह प्रोटोकॉल पौधे के मेजबान का उपयोग करके लीफहॉपर की लार में प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है। राइस ड्वार्फ वायरस (आरडीवी) से संक्रमित लीफहॉपर वेक्टर नेफोटेटिक्स सिंक्टिसेप्स एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है। एन सिंक्टिसेप्स की लार द्वारा वेक्टर किए गए आरडीवी के विटेलोजेनिन और प्रमुख बाहरी कैप्सिड प्रोटीन पी 8 का पता चावल के पौधे में एक साथ लगाया जा सकता है । यह विधि लार प्रोटीन के परीक्षण के लिए लागू होती है जो कीट खिलाने के बाद पौधे के मेजबान में क्षणिक रूप से बनाए रखी जाती है। यह माना जाता है कि पता लगाने की इस प्रणाली से हेमिप्टेरन-वायरस-प्लांट या हेमिप्टेरन-प्लांट इंटरैक्शन के अध्ययन को लाभ होगा।
अर्बोवायरस का वेक्टर-होस्ट ट्रांसमिशन मोड, एक मौलिक समस्या, जैविक विज्ञान की सीमा पर है। कृषि महत्व के कई पौधों के वायरस क्षैतिज रूप से कीट वैक्टर 1 द्वारा प्रेषित होतेहैं। आधे से अधिक पौधों के वायरस हेमिप्टेरन कीड़ों द्वारा वेक्टर किए जाते हैं, जिनमें एफिड्स, व्हाइटफ्लाई, लीफहॉपर, प्लांटहॉपर और थ्रिप्स शामिल हैं। इन कीटों में अलग-अलग विशेषताएं हैं जो उन्हें पौधों के वायरस को कुशलतापूर्वक संचारित करने मेंसक्षम बनाती हैं। उनके पास भेदी-चूसने वाले मुंह के हिस्से होते हैं और फ्लोएम और जाइलम से रस पर फ़ीड करते हैं, और उनकी लार 1,2,3,4 का स्राव करते हैं। तकनीकों के विकास और सुधार के साथ, लार घटकों की पहचान और कार्यात्मक विश्लेषण गहन अनुसंधान का एक नया केंद्र बन रहे हैं। लार में ज्ञात लार प्रोटीन में कई एंजाइम शामिल हैं, जैसे पेक्टिनस्टरेज़, सेल्युलेज़, पेरोक्सीडेज, क्षारीय फॉस्फेट, पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज, और सुक्राज़, अन्य 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . लार में प्रोटीन में ऐसे कारक भी शामिल होते हैं जो मेजबान रक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं, जिससे कीड़ों के प्रदर्शन में बदलाव होता है, और प्रभावक जो मेजबान रक्षा को दबाते हैं, जो कीट फिटनेस और घटकों को बढ़ाता है जो मेजबान रोग प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं14,15,16,17। इसलिए, लार प्रोटीन कीड़े और मेजबान के बीच संचार के लिए महत्वपूर्ण सामग्री हैं। वायरस के संचरण के दौरान, छेदने वाले-चूसने वाले विरुलिफेरस कीड़ों की लार ग्रंथियों द्वारा स्रावित लार में वायरल प्रोटीन भी होते हैं। वायरल घटक लार के प्रवाह का उपयोग कीट से पौधे के मेजबान तक छोड़ने के लिए करते हैं। इसलिए, कीट लार वायरस-वेक्टर-होस्ट ट्राइट्रोफिक इंटरैक्शन को पुल करती है। विरुलिफेरस कीड़ों द्वारा स्रावित लार प्रोटीन के जैविक कार्य की जांच करने से वायरस-वेक्टर-होस्ट के संबंध को समझने में मदद मिलती है।
पशु वायरस के लिए, यह बताया गया है कि मच्छरों की लार वेस्ट नाइल वायरस (डब्ल्यूएनवी) और डेंगू वायरस (डीईएनवी) के संचरण और रोगजनकता की मध्यस्थता करती है। लार प्रोटीन एएसजी 34 डेंगू -2 वायरस प्रतिकृति और संचरण को बढ़ावा देता है, जबकि लार प्रोटीन एएवीए -1 ऑटोफैगी18,19 को सक्रिय करके डीईएनवी और जीका वायरस (जेडआईकेवी) संचरण को बढ़ावा देता है। मच्छरों का लार प्रोटीन डी 7 डीईएनवी विषाणुओं और पुनः संयोजक डीईएनवी लिफाफा प्रोटीन20 के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से विट्रो और विवो में डीईएनवी संक्रमण को रोक सकता है। पौधों के वायरस में, बेगोमोवायरस टमाटर पीली पत्ती कर्ल वायरस (TYLCV) सफेद मक्खी लार प्रोटीन बीएसपी 9 को प्रेरित करता है, जो पौधे के मेजबान की WRKY33-मध्यस्थता प्रतिरक्षा को दबा देता है, सफेद मक्खियों की वरीयता और प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए, अंततः वायरस21 के संचरण को बढ़ाता है। क्योंकि पौधों के मेजबानों में कीट लार प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन पशु मेजबानों से पीछे रह गया है, पौधे के मेजबानों में लार प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक स्थिर और विश्वसनीय प्रणाली की तत्काल आवश्यकता है।
चावल बौना वायरस (आरडीवी) के रूप में जाना जाने वाला पौधे का वायरस उच्च दक्षता के साथ और लगातार प्रचार तरीके से22,23 के साथ लीफहॉपर नेफोटेटिक्स सिंक्टिसेप्स (हेमिप्टेरा: सिकेडेलिडे) द्वारा प्रेषित होता है। आरडीवी को पहली बार एक कीट वेक्टर द्वारा प्रेषित होने की सूचना मिली थी और एशिया में चावल की गंभीर बीमारी का कारण बनता है24,25. विरियन आइकोसाहेड्रल और डबल-लेयर्ड गोलाकार है, और बाहरी परत में पी 8 बाहरी कैप्सिड प्रोटीन22 होता है। एन. सिंक्टिसेप्स में आरडीवी की परिसंचारी संचरण अवधि 14 दिन 26,27,28,29,30 है। जब आरडीवी लार ग्रंथियों में आता है, तो विषाणुओं को एक्सोसाइटोसिस जैसे तंत्रके माध्यम से लार ग्रंथियों में लार-संग्रहीत गुहाओं में छोड़ दिया जाता है। विटेलोजेनिन (वीजी) मादा कीड़ों 31,32,33 में अंडाणु के विकास के लिए आवश्यक जर्दी प्रोटीन अग्रदूत है। अधिकांश कीट प्रजातियों में 6-7 केबी का कम से कम एक वीजी प्रतिलेख होता है, जो लगभग 220 केडीए के अग्रदूत प्रोटीन को एन्कोड करता है। वीजी के प्रोटीन अग्रदूतों को आमतौर पर अंडाशय 18,19 में प्रवेश करने से पहले बड़े (140 से190 केडीए) और छोटे (<50 केडीए) टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है। पिछले प्रोटिओमिक विश्लेषण ने लीफहॉपर रेसिलिया डोरसैलिस के स्रावित लार में वीजी से प्राप्त पेप्टाइड्स की उपस्थिति का खुलासा किया, हालांकि उनका कार्य अज्ञात है (अप्रकाशित डेटा)। यह नई बताया गया है कि वीजी, जो मौखिक रूप से प्लांटहॉपर से स्रावित होता है, पौधों की सुरक्षा को नुकसान पहुंचाने के लिए एक प्रभावक के रूप में कार्य करता है। यह अज्ञात है कि क्या एन सिंक्टिसेप्स के वीजी को लार प्रवाह के साथ पौधे के मेजबान को भी जारी किया जा सकता है, और फिर पौधे की सुरक्षा में हस्तक्षेप करने के लिए पौधे में भूमिका निभा सकता है। यह पता लगाने के लिए कि क्या एन सिंक्टिसेप्स लार प्रोटीन का शोषण करता है, जैसे कि वीजी, पौधे की सुरक्षा को रोकने या सक्रिय करने के लिए, पहला कदम भोजन के दौरान पौधे को जारी प्रोटीन की पहचान करना है। पौधे में मौजूद लार प्रोटीन की पहचान करने की विधि को समझना लार प्रोटीन के कार्य और हेमिप्टेरा और पौधों के बीच बातचीत को समझाने के लिए संभावित रूप से आवश्यक है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, एन सिंक्टिसेप्स का उपयोग कीट आहार के माध्यम से पेश किए गए पौधे के मेजबान में लार प्रोटीन की उपस्थिति की जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। प्रोटोकॉल मुख्य रूप से लार प्रोटीन के संग्रह और पता लगाने का विवरण देता है और अधिकांश हेमिप्टेरान्स पर आगे की जांच के लिए सहायक है।
छेदने वाले-चूसने वाले कीड़ों की लार ग्रंथियों द्वारा सीधे स्रावित लार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है क्योंकि यह मेजबान ऊतकों और वैक्टर के क्रॉस-किंगडम जैविक कारकों को मेजबान 1,3,4…
The authors have nothing to disclose.
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31772124 और 31972239) और फ़ुज़ियान कृषि और वानिकी विश्वविद्यालय (ग्रांट केएसआईएलएक्स 014) से अनुदान द्वारा समर्थित था।
Reagents | |||
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
Buffers and Solutions | |||
Buffer | Composition | Comments/Description | |
5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
Instruments | |||
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |