Denne protokollen beskriver bruk av kommersielle, cellefrie proteinuttrykkssett for å produsere membranproteiner støttet i nanodisc som kan brukes som antigener i subenhetsvaksiner.
Subenhetsvaksiner gir fordeler i forhold til mer tradisjonelle inaktiverte eller svekkede helcellederiverte vaksiner i sikkerhet, stabilitet og standardproduksjon. For å oppnå en effektiv proteinbasert subenhetsvaksine må proteinantigenet ofte vedta en innfødt-lignende konformasjon. Dette er spesielt viktig for patogen-overflateantigener som er membranbundne proteiner. Cellefrie metoder har blitt brukt til å produsere riktig foldet funksjonelt membranprotein gjennom samoversettelse av nanolipoproteinpartikler (NLP), kjent som nanodisker.
Denne strategien kan brukes til å produsere subenhetsvaksiner bestående av membranproteiner i et lipidbundet miljø. Imidlertid er cellefri proteinproduksjon ofte begrenset til småskala (<1 ml). Mengden protein produsert i småskala produksjonsserier er vanligvis tilstrekkelig for biokjemiske og biofysiske studier. Den cellefrie prosessen må imidlertid oppskaleres, optimaliseres og testes nøye for å oppnå nok protein til vaksinestudier i dyremodeller. Andre prosesser involvert i vaksineproduksjon, som rensing, adjuvant tillegg og lyofilisering, må optimaliseres parallelt. Dette papiret rapporterer utviklingen av en oppskalert protokoll for å uttrykke, rense og formulere en membranbundet proteinsubenhetsvaksine.
Oppskalerte cellefrie reaksjoner krever optimalisering av plasmidkonsentrasjoner og forhold ved bruk av flere plasmidekspresjonsvektorer, lipidseleksjon og adjuvans tilsetning for høynivåproduksjon av formulerte nanolipoproteinpartikler. Metoden er her demonstrert med ekspresjon av et klamydialt stort ytre membranprotein (MOMP), men kan i stor grad brukes på andre membranproteinantigener. Antigeneffektivitet kan evalueres in vivo gjennom immuniseringsstudier for å måle antistoffproduksjon, som vist her.
Prokaryote eller eukaryote lysater for cellefri ekspresjon av proteiner er lett tilgjengelige som kommersielle produkter for syntetisering av proteiner av interesse (for en fullstendig gjennomgang, se 1). Disse ekspresjonssystemene er tilgjengelige på forskjellige skalaer og benytter lysater fra forskjellige organismer, inkludert E. coli, tobakkplanter og pattedyrkulturer. Cellefrie lysater gir flere fordeler i forhold til tradisjonelle rekombinante proteinproduksjonsmetoder, inkludert brukervennlighet og robust, rask proteinproduksjon. Selv om disse tilnærmingene primært brukes til å produsere løselige proteiner, har denne gruppen banebrytende en tilnærming for deres bruk for å uttrykke membranproteiner.
Denne nye tilnærmingen gjør mindre endringer i eksisterende cellefrie ekspresjonssystemer ved å inkludere DNA som koder for to proteinprodukter for ekspresjon, et apolipoprotein og membranproteinet av interesse. Det uttrykte apolipoproteinet (derivater av enten ApoA1 eller ApoE4) interagerer med lipider tilsatt til det cellefrie lysatet for spontant å sette sammen (~ 20 nm) NLP. Når det oversettes sammen med et membranprotein av interesse, danner NLP og membranproteinet et løselig nanopartikkelkompleks hvor membranproteinet er innebygd i NLP-lipid-dobbeltlaget. Dermed er membranproteinet mer tilgjengelig for nedstrøms applikasjoner, da det er inneholdt i løselige, diskrete partikler. Denne tilnærmingen kan produsere funksjonelle oligomere proteinkomplekser i NLP-dobbeltlaget2 og kan produsere antigenkomponenten i en subenhetsvaksine, som deretter blandes med lipofile adjuvanser for å danne en nanopartikkelvaksine med samlokalisert antigen og adjuvans egnet for in vivo-vurdering .
Denne nåværende metoden er modifisert fra en tidligere publisert protokoll3. Nøkkelmodifikasjoner er fokusert på oppskalering av den cellefrie reaksjonen og påfølgende rensing av protein-NLP-komplekset. En ytterligere modifikasjon inkluderer tilsetning av en amfifil polymer kjent som en telodendrimer, som først blandes med lipidene før tilsetning til den cellefrie reaksjonen. Samtranslasjon av plasmidene i nærvær av telodendrimeren og lipidene produserer en telodendrimer NLP (tNLP). Tilsetningen av telodendrimeren bidrar også til å modulere størrelsen og monodispersiteten til de resulterende tNLP nanopartiklene4. Denne protokollen er spesielt optimalisert for storskala vaksinestudier for å produsere et membranbundet subenhetsantigenprotein, klamydial MOMP 5,6. Metoden produserer rekombinant MOMP assosiert med tNLP for å danne et høyoppløselig MOMP-tNLP-kompleks som beholder MOMP-oligomerisering. En typisk oppskaleringsproduksjon på 3 ml gir >1,5 mg renset MOMP. Den cellefrie produserte MOMP-tNLP er egnet til rask adjuvant tilsetning for in vivo immunogenisitetstesting.
Klamydia er den vanligste seksuelt overførbare infeksjonen som rammer både menn og kvinner. Selv om vaksineforskning på klamydia strekker seg over flere tiår, har en trygg og effektiv vaksine som kan skaleres til masseproduksjon vært unnvikende13. Den klamydiale MOMP regnes som hovedkandidaten som et beskyttende vaksineantigen; MOMP er imidlertid svært hydrofob og utsatt for feil folding14,15. Videre studier har vist at MOMP eksisterer i oligomere tilstander som er essensielle for immunogeniteten11. Detaljert her er en validert, cellefri samuttrykksmetode som produserer oligomere MOMP dannet i tNLP nanopartikkel som en vaksine, med utbytter på ca. 1, 5 mg renset MOMP per 3 ml lysat. Denne fullt sammensatte prosedyren kan skaleres ytterligere for industriell produksjon, og øke utsiktene som en nyttig tilnærming for å generere vaksiner.
Vi har tidligere publisert om bruk av cellefritt uttrykk for å produsere membranproteiner innebygd i NLP 3,16, samt ekspresjon i telodendrimerstabiliserte skiver. Imidlertid produserte denne sistnevnte teknikken membran-proteinpartikler med større heterogenitet og lavere oppløselighet. 4 I tillegg er immunogeniteten til MOMP-telodendrimerpartikler uklar sammenlignet med MOMP-tNLP-partikler6.
Denne prosedyren kan tilpasses for å skalere opp uttrykket av bakterielle membranproteiner som er lovende kandidater som antigener for bruk i subenhetsvaksiner. Ikke bare produserer denne prosedyren løselig bakteriell membranprotein, men den generelle nanopartikkelstrukturen er egnet til ytterligere modifikasjon ved hjelp av en rekke lipofile vaksinehjelpestoffer, inkludert, men ikke begrenset til, CpG konjugert til en kolesteroldel eller FSL-1. Ekspresjon av andre kandidatantigener fra bakterier er mulig, selv om parametere som ekspresjonstemperatur, lipidvalg og type ekspresjonssystem kanskje må utforskes for å oppnå optimale utbytter.
I tillegg er plasmidvalg og forhold kritisk i denne prosessen. Begge plasmidene som brukes skal være konstruert fra samme ryggrad. Hvis innsatsene er omtrent like lange, kan forholdene baseres på massen av plasmidet som er tilsatt, som beskrevet her. Imidlertid vil rasjonering basert på føflekker gi mer reproduserbare resultater, spesielt ved skalering av reaksjonene. Forhold som fungerer bra i skjermskalareaksjoner (< 0,5 ml) kan ikke gjelde for større reaksjoner og kan kreve ytterligere optimalisering. Ikke-membranproteiner kan fortsatt uttrykkes ved hjelp av cellefrie sett, men kan ikke kreve lipidnanopartikkelen (samuttrykk) for å produsere et løselig produkt. I tillegg, mens denne protokollen beskriver adjuvans med CpG og FSL-1, er dette systemet egnet til formulering med andre lipofile hjelpestoffer eller blanding med løselige hjelpestoffer etter ønske.
Det er viktig å unngå forurensning når du setter opp den cellefrie uttrykksreaksjonen, da dette kan påvirke utbyttet. Eventuelle tilsetningsstoffer til reaksjonen, inkludert plasmidene selv, bør være svært rene. I tillegg bør de uttrykte proteinene bare være i kontakt med materialer og løsninger som er fri for endotoksinforurensning. Endotoksinforurensning i kandidatformuleringer kan føre til inkonsistente og falske resultater av immunologiske analyser og kan være skadelig i tilstrekkelige mengder. Selv om det ikke er beskrevet her, kan ytterligere rensing etter nikkelaffinitetskromatografi være nødvendig hvis mange kontaminanter observeres i påfølgende analysetrinn, for eksempel gjennom SDS-PAGE. Dette kan oppnås med SEC, selv om forholdene kan kreve optimalisering på en formulering ved formulering basis.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Public Health Service grant R21 AI20925 og U19 AI144184 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Dette arbeidet ble utført i regi av US Department of Energy av Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
Electrophoresis Power Supply | |||
Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
Lyophilizer | Labconco | ||
Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
Microcentrifuge | |||
Microwave oven | |||
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
Orbital Shaker | |||
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
Probe sonicator | |||
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
Rainin Pipettes | Rainin | ||
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
UV light source | |||
Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
Vortexer | |||
VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |