Profileringskänslighet mot riktade terapier i EGFR-mutanta NSCLC patientbaserade organoider

Summary

Detta protokoll beskriver en standardiserad utvärdering av läkemedelskänslighet till riktade signaleringshämmare i NSCLC patient-härledda organoid modeller.

Abstract

Nya 3D cancer organoid kulturer härrör från kliniska patient exemplar representerar ett viktigt modellsystem för att utvärdera intratumor heterogenitet och behandling svar på riktade hämmare i cancer. Banbrytande arbete inom mag- och bukspottkörtelcancer har belyst löftet om patient-härledda organoider (PDU) som ett patientproximat kultursystem, med ett ökande antal modeller som dyker upp. På samma sätt har arbetet i andra cancertyper fokuserat på att etablera organoida modeller och optimera kulturprotokoll. I synnerhet upprätthåller 3D-cancerorganoidmodeller den genetiska komplexiteten hos ursprungliga tumörprover och översätter därmed tumör-härledda sekvenseringsdata till behandling med genetiskt informerade riktade terapier i en experimentell miljö. Vidare kan PDO främja utvärderingen av rationella kombinationsbehandlingar för att övervinna resistens-associerade anpassning av tumörer i framtiden. Det senare fokuserar på intensiva forskningsinsatser inom icke-småcellig lungcancer (NSCLC), eftersom resistensutveckling i slutändan begränsar behandlingsframgången för riktade hämmare. En tidig bedömning av terapeutiskt målbara mekanismer med hjälp av NSCLC PDU kan bidra till att informera rationella kombinationsbehandlingar. Detta manuskript beskriver ett standardiserat protokoll för cell kultur platt-baserade bedömning av läkemedelskänslighet till riktade hämmare i NSCLC-härledda 3D PDO, med potentiell anpassningsförmåga till kombinationsbehandlingar och andra behandlingsmetoder.

Introduction

Personliga terapier mot onkogena förare har revolutionerat cancerbehandling, förbättrat patientens överlevnad och minskat behandlingsmedierade ^{biverkningar1}. De senaste framstegen inom molekylär diagnostik och sekvensering teknik har belyst komplexiteten i mänskliga tumörer, med rumsliga och tidsmässiga heterogenitet påverkar behandling ^svar2. Rekapitulering av dessa subklonala skillnader i cellodlingsmodeller har länge begränsats till att undersöka utvalda förändringar av intresse för annars enhetliga cellinjer. Nyutvecklade 3D PDO modeller genereras från tumör tarmbiopsier eller kirurgiska tumör samband möjliggör förbättrad representation av cellulära komplexitet och signalering crosstalk inom patienten-härledda tumör ^vävnad3. Som sådan har tumör organoider härrör från mag-tarm- och bukspottkörtelcancer framgångsrikt genererats och rekapitulera den genetiska mångfalden och bestämningsfaktorerna för behandlingssvar4,5,6. Vid icke-småcellig lungcancer (NSCLC) erkänns organoidutvecklings- och etableringsutmaningar, och optimering av kulturtekniker och selektiva mediefaktorer behövs för att möjliggöra bredare och mer systematisk användning av NSCLC-PTO i ^framtiden7,8.

Att utveckla kombinatoriska terapier riktade mot kvarvarande tumörceller som tål initial läkemedelsbehandling är avgörande för att hämma resistensutveckling och i slutändan förbättra patientens ^överlevnad9. Med tanke på den arkitektoniska komplexiteten i organoida kulturer måste parametrar för klassiska läkemedelssvar optimeras för att möjliggöra noggrann och reproducerbar testning av läkemedelskänsligheter. Bildbaserade ^{avläsningar10,11} och klassiska cellviabilitetsanalyser som mäter cellulär ATP-överflöd6,12, bland andra tekniker, finns tillgängliga för att profilera läkemedelssvar i subdokulturer. Här utvecklar och beskriver vi ett standardiserat protokoll för att utvärdera läkemedelskänslighet till riktad terapi mot kända kliniska förare i NSCLC PDO-modeller.

Protocol

För humanpersonsforskning erhölls informerat samtycke och vävnadsinsamling utfördes enligt UCSF Internal Review Board godkända protokoll (IRB, protokoll nr: #13-12492 eller CC #17-23309). Etableringen av organoidkulturer från avidentifierade kliniska prover utfördes i samarbete med forskningspartners enligt tidigare publicerade metoder13,14,15,16. Organoid kulturer hämtades för underhåll och drog eskalering experiment vid passage tre eller senare. Alla följande protokoll utfördes under aseptiska förhållanden i en däggdjur vävnad kultur laboratoriemiljö. Bild 1: Protokollschema för arbetsflöde och kritiska steg i tekniken. (A) Experimentellt arbetsflöde inklusive sådd av organoider i 96-välformat, behandling med läkemedelsupptrappning 7 dagar efter sådd och luminiscensbaserad cellöverlevnadsavläsning 5 dagar efter behandling med hjälp av en ELISA-plattläsare. (B) En exempelbild av de EGFRdel19-positiva TH107- och EGFRL858R-positiva th330 NSCLC-organoidkulturerna. Ursprungliga kulturer, celler vid tidpunkten för sådd (dag 0) och organoider vid behandling börjar 7 dagar efter sådd (dag 7). Skalstång = 100 μm. Förändringar i organoiddiameter under den inledande 7-dagars kulturperioden kvantifieras och indikerar >2-faldig ökning av organoidens storlek. Relativa vikningsförändringar i storlekar på dag 7 jämfört med genomsnittlig storlek på dag 0 presenteras under de representativa bilderna. För TH107 observeras en vikändring på 2,38 under 7 dagar, vilket indikerar en fördubblingstid på 5,88 dagar (141,12 timmar). För TH330 observeras en vikändring på 2,41 under 7 dagar, vilket indikerar en fördubblingstid på 5,81 dagar (139,42 timmar). Kvantifiering av förändringar i organoidstorlek och statistisk utvärdering presenteras (höger). Statistisk signifikans beräknas med oparat t-test, s < 0,0001. (C) Behandlingslayout för läkemedelsupptrappning i organoid 96-well plate format. Antalet tekniska replikat och föredömliga doser anges, inklusive en negativ kontroll. Ritningarna skapas med BioRender, ett webbaserat illustrationsverktyg. Klicka här för att se en större version av den här figuren. 1. Experimentella preparat Förbered tillväxtmediet (GM) som tidigare rapporterats15: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Hams näringsblandning F12 (DMEM/F-12) med L-alanyl-L-glutamin, kompletterat med 100 U/mL penicillin/streptomycin, 10 mM HEPES, 25 nM hRspondin, 1x B27, 5 mM Nicotinamid, 1,25 mM N-Acetylcysteine, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/mL Primocin, 50 00 25 ng/mL hFGF-7 (se Tabell över material).OBS: Blanda försiktigt för att undvika skumbildning och filtrera genom ett filtreringssystem på 0,22 μm. Varmt medium till 37 °C inom 1 h före användning. Förbered lågtillväxtfaktormedier (LGM) som tidigare rapporterats16 utan tillsats av epidermal tillväxtfaktor (EGF): Advanced Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Hams näringsblandning F12 (DMEM/F-12), kompletterad med 1 mM HEPES, 1x L-alanyl-L-glutamin, 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin, 10 mM Nicotinamid, 1 mM N-Acetylcysteine, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/mL hNoggin.OBS: Blanda försiktigt för att undvika skumbildning och filtrera genom ett 0,22 μm-filter. Varmt medium till 37 °C inom 1 h före användning. Tina BME2 (Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Typ 2, se Tabell över material) på is, vid 4 °C, över natten. 2. Generera encellig suspension och sådd av celler Dissociera nedsänkt BME2 organoid kultur enligt beskrivningen i följande steg (2.1.1-2.1.6). Aspirera försiktigt media från kulturplattorna. Undvik att röra vid den nedsänkta BME2 organoidkulturen.OBS: Media Aspiration kan göras som forskaren föredrar, t.ex. med ett grundläggande vätskeambitionssystem eller med hjälp av en pipett. Undvik att vidröra BME2 inbäddade organoider eftersom detta kan leda till förlust av organoid biomassa. Prova den nedsänkta BME2-organoidkulturen med ett lämpligt rekombinant enzym (se Materialtabell). I 6-brunnsplåtformat, tillsätt 2 ml per brunn. Bryt BME2 mekaniskt genom att upprepade gånger pipettera upp och ner. Inkubera plattor vid 37 °C i cellodlingsinkubatorn i 5 min. Överför suspensionen till ett 15 ml centrifugrör och centrifug vid 600 x g i 5 min vid rumstemperatur. Aspirera det rekombinanta enzymet noggrant utan att röra den organoida pelleten.OBS: Rest BME2 kan förekomma. Upprepa enzymrötningen om det behövs. Återsuspend organoidpelleten i GM (steg 1.1). Tillsätt DNase I 1x 100 U/mL och inkubera i 5 min vid rumstemperatur (se Materialtabell). Centrifugera vid 600 x g i 3 min vid rumstemperatur. Pipettera försiktigt bort media utan att röra vid den organoida pelleten och kassera. Återanvänds i färsk GM. Sådd av organoid encellssuspensionFörvärm en ny svart, klar botten 96-brunnsplatta vid 37 °C i cellodlingsinkubatorn i 10 min.OBS: Att använda tydliga bottenplattor är viktigt för att övervaka organoid tillväxt och läkemedelssvar. Vid räkning, förbered en 1:5 utspädning av cellupphängningen i PBS (total volym: 500 μL) och räkna cellupphängningen med hjälp av en cellanalysator (se Tabell över material).OBS: Se till att multiplicera med utspädningsfaktorn (x 5) för att få den slutliga cellkoncentrationen. Alternativa räkningsmetoder som en hemocytometer kan användas. Cellens livskraft bör övervakas med hjälp av en analys av livsduglighetsfärgning (t.ex. med Trypan Blue17). Med hjälp av en cellanalysator utvärderas livskraften automatiskt. Livskraften hos organoida encellsavstängningar som utvärderas av cellanalysatorn bör vara ≥95% (kompletterande figur 1). Beräkna volymen av cellavstängningen som behövs för att så till experimentet.OBS: Såddkoncentrationen är 1500 celler/μL BME2, med 5 μL BME2 behövs per brunn (Totalt antal: 7500 celler/brunn). För en 96-brunnsplatta krävs 6 x 10E5 celler. Detta inkluderar sådd av 60 brunnar med organoidkupoler (4,5 x 10E5) och experimentellt överskott (beräkning för totalt 80 brunnar). Förbered en alikvot cellfjädring i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör per varje 96-brunnsplatta som planeras att sås om flera 96-brunnsplattor ingår i experimentet.OBS: Experimentellt överskott och separata alikvoter per sådd 96-brunnsplatta behövs för att ta hänsyn till den ökade experimentella biasen på grund av hantering av BME2. Alikvotceller från encellsfjädringen beräknat (steg 2.2.3) efter noggrann resuspension genom pipettering upp och ner. Pelletsceller vid 600 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort mediet med en P200-pipett utan att vidröra cellpelleten. Placera cellpelleten på is inom kort (~1 min) och återanvänd cellpelleten i BME2.OBS: Restmedier kan äventyra BME2-strukturen och styvheten. Pipett bort alla medier försiktigt. Placera cellerna på isen inom kort för att acklimatisera cellpelleten och låta cellerna återanvändas i BME2 utan att klumpa ihop sig. Håll BME2 på is hela tiden för att den ska hålla sig i flytande tillstånd. För en 96-brunnsplatta behövs 400 μL BME2 för återpension av cellpelleten. Resuspend cell pellets försiktigt, undvika införandet av bubblor. Luta din förvärmda svarta, klarbottnade 96-brunnsplatta mot dig. Pläterar celler som använder 5 μL cellfjädring per brunn och såddcellkupoler vid 6-tidens läge för varje brunn (figur 1A).  Frö cellkupolerna i de återstående inre brunnarna (kolumnerna 2-10 och raderna B-G på en 96-brunnsplatta).OBS: Backrörning18 rekommenderas vid hantering av BME2. Flytta inte 96-brunnsplattan och inkubera nysådda cellkupoler i cellkulturens laminära flödeshuva i 5 min vid rumstemperatur. Flytta sedan plattan till cellodlingsinkubatorn och inkubera den i 10 min vid 37 °C. Tillsätt försiktigt 100 μL GM per brunn till alla brunnar som innehåller organoider (kolumnerna 2-10 och raderna B-G på en 96-brunnsplatta). Tillsätt 100 μL PBS till de yttre brunnarna vid plattans kant. Kultur BME2 inbäddade organoider i GM-media vid 37 °C i cellodlingsinkubatorn i totalt 7 dagar. Inspektera tillväxten av organoider under ljusmikroskopet regelbundet.OBS: Se figur 1B och tilläggstabell 1 för ett exempel på förväntad tillväxtutveckling från sådd till behandlingsdag. Byt media en gång efter 3-4 dagars kultur: rotera plattan medurs med 180° (organoider nu vid 12-tidens position), aspirera försiktigt GM från motsatt position till organoid kupol med hjälp av en flerkanalsapparat om tillgänglig och tillsätt sedan ny GM. 3. Läkemedelsbehandling Förbered en seriell läkemedelsutspädning i LGM för det läkemedel som valts, t.ex. osimertinib, för behandling av EGFR-mutanta NSCLC-organoider. Inkludera en negativ kontroll (LGM-media + 0,1% DMSO). Förbered tillräckligt med läkemedels alikvoter av alla doser enligt antalet brunnar sådda plus experimentellt överskott.OBS: En utspädningsserie med ≥8 doser och från 1 nM-10 μM rekommenderas för riktade hämmare. Rotera den organoida plattan medurs med 180° (organoider nu vid 12-tidens position). Aspirera försiktigt gm med en flerkanalsapparat helst.OBS: Undvik att vidröra den organoida kupolen medan du aspirera gm eftersom detta kan leda till förlust av organoid biomassa och slagresultat. Tillsätt 100 μL kontroll (t.ex. LGM-media + 0,1% DMSO) eller läkemedelslösning per brunn.OBS: Se figur 1C för läkemedelsupptrappningsbehandlingen schematisk i 96-brunnsplatta format. Inkubera behandlade organoider vid 37 °C i cellodlingskuvuvösen i 5 dagar. 4. Avläsning genom luminiscensbaserad överlevnadsanalys Avläsning av skörd och överlevnad Utför överlevnadsanalysen enligt Reference19. Tina reagens (se Materialtabell) över natten vid 4 °C. Ekvilibrera reagens i ett vattenbad i rumstemperatur i 30 minuter före användning och blanda genom invertering. Tillsätt en lika stor mängd reagens till varje brunn (100 μL per brunn). Blanda noggrant genom pipettering upp och ner, med pipettspetsen placerad vid den organoida kupolens position. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur i mörkret. Överför med hjälp av en flerkanalspipett cirka 75 % (150 μL) av lysat (steg 4.1.1.2) till en ny vit, ogenomskinlig 96-brunnsplatta.OBS: Överföring av 75% av lysat till en ny platta säkerställer frånvaron av bubblor i den senare avläsningen utan att påverka analyskänsligheten. Inkubera i ytterligare 25 min vid rumstemperatur i mörkret. Spela in luminiscens med en ELISA-plattläsare (integrationstid 0,25-1 s/per brunn) (se Materialtabell). Spara data i ett lämpligt format, t.ex. en datatabell som innehåller alla råa avläsningar och registrering av tallrikslayouten och de läkemedel som används. Dataanalys med hjälp av programvara för statistisk analys (se Materialförteckning) Skapa en ny XY-tabell och infoga data i XY-format: Raderna (X) är negativ kontroll följt av eskalerande läkemedelsdoser, med doser som log [Inhibitor] i Molar-koncentration. Kolumner (Y) är avläsningsvärden som innehåller replikat staplade tillsammans med kolumner.OBS: Koncentrationen av den negativa kontrollen ska anges som ett minimalt värde (givet 0 är inte möjligt i loggskala), t.ex. logg [Inhibitor], M = -10. Normalisera värden genom att välja Analysera > normalisera och använda följande parametrar: normalisera varje underkolonn separat, Y = 0 som 0 %, “sista värdet i varje underkolonn (eller först, beroende på vilket som är störst)” som 100 %, resulterar i procent, diagram resultaten. Passa icke-linjär regressionskurva på normaliserade data genom att välja Analysera > XY-analyser > icke-linjär regression > dosrespons – hämning > stock (inhibitor) vs . normaliserad respons — Variabel lutning. Rapportera resultat som en tabell över IC50-värden som utmatats efter icke-linjär regressionsanalys och diagram över svarskurvan inklusive normaliserade datapunkter som genomsnittlig +/- standardavvikelse och monterad regressionskurva.

Representative Results

Betydande utmaningar vid upprättandet av NSCLC organoider har noterats7. Därför är det spännande att se det senaste arbetet med att etablera lungcancerorganoider och använda dem för läkemedelsbehandlingsanalyser20,21,22. EGFR-mutationer står för 11,3% av NSCLC fall23. Målinriktad behandling med EGFR-hämmare utgör förstahandsbehandlingsalternativet i EGFR-mutant NSCLC och har förbättrat den totala överlevnads- och behandlingssäkerheten hos patienter24. Detta arbete fastställde känsligheten för DEN FDA-godkända EGFR tyrosinkinashämmaren osimertinib24,25 i EGFR-mutanta NSCLC-organoider. EGFR-mutant NSCLC organoider genererades från kirurgiska samband eller tumör biopsi exemplar av NSCLC patienter och bekräftade att hysa den anges onkogen mutationen genom DNA sekvensering. Som beskrivits ovan behandlades EGFR- mutanta NSCLC organoid modeller med eskalerande doser av osimertinib och PDO livskraft bedöms av luminescence-baserade cell överlevnad avläsning fem dagar efter behandling inledande. Medan EGFR mutant (EGFRdel19)-positiva TH107 organoider visade känslighet för osimertinib behandling med en halv-maximal hämmande koncentration (IC50) av 56 nM (figur 2A), EGFR-mutant (EGFRL858R)-positiva TH116 organoider var resistenta mot osimertinib behandling med en IC50 av större än 1 μM (figur 2B). Känsligheten hos EGFRdel19-positiva TH107 NSCLC åtföljdes av betydande transkriptionella förändringar, inklusive en minskning av uttrycket av cellcykel-associerade gensignaturer och en ökning av uttrycket av apoptos-associerade gensignaturer (kompletterande figur 2A,B). Som referens presenteras svarsdata för den känsliga EGFRdel19-positiva NSCLC-cellinjen PC9 (figur 3A, B). Den senare inkluderar överlevnadsanalys till eskalerande doser av osimertinib med en 2D luminiscensbaserad överlevnadsanalys (figur 3A) och studier av signaldämpning på egfr-MAPK-signalering av western blot (figur 3B). Sammantaget belyser dessa data noggrannheten i detta protokoll för att bestämma läkemedelssvar och skilja mellan känsliga och resistenta NSCLC PDO-modeller. Ytterligare analyser av EGFRL858R-positiva TH116 organoid och tillgängliga kliniska exemplar behövs för att fastställa möjliga resistens-associerade förändringar. Figur 2: Behandling svar kurva av EGFR-mutant NSCLC organoid modeller till osimertinib eskalering. (A) Osimertinib svar i den känsliga EGFRdel19-positiva TH107 NSCLC organoid modell. (B) Osimertinib-svar i den resistenta EGFRL858R-positiva th116 NSCLC-organoidmodellen. Datapunkter presenteras som normaliserade värden som visar medelvärdet +/- standardavvikelse, med en icke-linjär regressionskurva monterad genom data. TH107, n = 6 tekniska replikat per datapunkt. TH116, n = 4 tekniska replikat per datapunkt. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 3: Jämförande data för behandlingssvaret på osimertinib i en känslig EGFR-mutant NSCLC-cellinje och organoidmodeller som odlas i olika medier. (A) Osimertinib-respons i den känsliga EGFRdel19-positiva NSCLC-cellinjen PC9, bestämd med standardanalys av 2D-CTG. (B) Signaldämpning i PC9-cellerna vid två dagars behandling med osimertinib (2 μM). C) Osimertinib-svar i den känsliga EGFRL858R-positiva TH330 NSCLC-organoidmodellkulturen i LGM- och GM-medier. D) Osimertinib-svar i den resistenta az021 NSCLC-organoidmodellen i LGM- och GM-medier. Bekräftelse av den onkogena EGFRL858R mutationen i AZ021 misslyckades och kan vara orsakar för bristen på osimertinib svar. För A och C-D presenteras datapunkter som normaliserade värden som visar medelvärdet +/- standardavvikelse, med en icke-linjär regressionskurva monterad genom data. PC9, n = 3 tekniska replikat per datapunkt. TH330, n = 5 tekniska replikat per datapunkt. AZ021, n = 6 tekniska replikat per datapunkt. Ett Wilcoxon-rangtest utfördes på normaliserade data för att bestämma den statistiska signifikansen. För TH330 (C), LGM vs. GM, ** p = 0,0078. För AZ021 (D), LGM jämfört med GM, ns p = 0,0742. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Kompletterande figur 1: Representativa cellanalysresultat för räkning och lönsamhetsbedömning av EGFR-mutanta organoidmodeller. TH107 och TH107BC hänvisar till olika organoidmodeller och A och B till biologiska replikat. För varje modell och biologisk replikat räknas tre tekniska replikat. alla visar ≥95% lönsamhet. En representativ bild under cellräkning presenteras till höger, som visar robust livskraft och encellig dissociation. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 2: GSEA (Gene Set enrichment analysis) med hjälp av bulk RNA-sekvenseringsdata som erhållits för EGFR-mutanta TH107 NSCLC-organoider, där obehandlad kontroll (DMSO) och celler som behandlats med Osimertinib jämförs i 3 dagar (OSI_D3). (A-B) Vid riktad behandling kommer känsliga celler att genomgå cellcykel G1 gripande och upphöra med aktiv spridning. Eftersom ett uttryck för G2M-cellcykelgener är förknippat med aktiv spridning förväntas en nominell berikning av uttryck i den obehandlade kontrollen (DMSO). För apoptosrelaterade gener förväntas en nominell berikning i behandlade celler (OSI_D3). Båda har bekräftats i egfr-mutant TH107 NSCLC organoid modell behandlas med Osimertinib: (A) GSEA för Hallmark G2M uttryck signatur (vänster) visar berikning i DMSO- behandlade celler. Nominell anrikningspoäng (NES): +1.708, FDR < 0.0001. (B) GSEA för Hallmark Apoptos uttryck signatur (höger) visar berikning i Osimertinib-behandlade celler. NES: -1.075, FDR: ns, 0.3275. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 3: Kombinatorisk läkemedelsbehandling i EGFR-mutant TH330-organoidmodell som behandlats med Osimertinib-eskalering i närvaro av en andra additiv hämmare vid en fast koncentration. Resistensrelaterade förändringar i EGFR-mutantA NSCLC, dvs. SRC- och AXL-aktivering26,27,28, var farmakologiska med kombinatorisk behandling med SRC-hämmaren Saracatinib (100 nM) eller AXL-hämmaren R428 (500 nM), n = 6 tekniska replikat per datapunkt. Båda kombinatoriska behandlingarna resulterade i ökat behandlingssvar, med betydelse för kombinationen av Osimertinib med SRC-hämmaren Saracatinib. Statistisk signifikans utvärderades av Wilcoxon rank test: Osimertinib kontra Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195; Osimertinib mot Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. Klicka här för att ladda ner den här filen. Tilläggstabell 1: Ändring av organoidstorlek från sådd (d0) till 7 dagar efter behandlingen (d7). (A) Tillväxtutveckling i EGFRdel19-positiv NSCLC-organoid TH107. (B) Tillväxtutveckling i EGFRL858R-positiv NSCLC-organoid TH330. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Detta manuskript utvecklar och beskriver ett standardiserat protokoll för bedömning av läkemedelskänslighet i NSCLC-härledda 3D-PDO-modeller. Förutom läkemedelskänslighetsstudier behövs ytterligare karakterisering av tillgängliga organoidmodeller för att bestämma de underliggande orsakerna till skillnader i läkemedelskänslighet. Detta kan inkludera genetisk profilering av organoider och patientprover och annan analys tillgänglig för organoider, såsom immunohistokemi färgning för differentieringsmarkörer och allmänna cellulära signaleringsbiomarkörer och ^{fysiologi13,29}.

Kritiska steg i protokollet
Protokollet som beskrivs häri ger ett standardiserat arbetsflöde som möjliggör exakta och reproducerbara läkemedelskänslighetsanalyser när de följs noggrant. Särskild försiktighet bör iakttas i följande steg: TrypLE och DNAse I matsmältning under generering av encelliga suspensioner, sådd av encellsuppskov i BME2, övervakning av organoidtillväxt tills behandling, mediaförändringar och störningar och lys av BME2 inbäddade organoider under luminiscensbaserad cellöverlevnadsavläsning. (1) Medan ytterligare DNAse I-matsmältning efter TrypLE-baserad dissociation av organoider inte är nödvändig för att expandera organoida modeller under regelbundet kulturunderhåll, bör DNAse I-matsmältningen inte utelämnas vid sådd för läkemedelsupptrappningsexperiment eftersom det säkerställer bättre separation av organoidkluster till encellsupphängningar och korrekt cellräkning. (2) Sådd av encellsfjädring i BME2 är ett kritiskt steg med tanke på stelningen av BME2 vid rumstemperatur. Således måste högst 1-2 rader sås på en gång, och prover bör placeras på is innan ytterligare rader sås. Observera att celler måste pipetteras upp och ner när sådd fortsätter för att möjliggöra en homogen cell suspension. (3) Organoidtillväxten måste övervakas noggrant under den 7 dagar långa expansionen från sådd till behandling. Ett exempel på den förväntade utvecklingen ges i figur 1B och tilläggstabell 1. Observera att bedömning av förändringar i organoidstorlek genom brightfieldmikroskopi och bildanalys enligt figur 1B kan möjliggöra en exakt utvärdering av skillnader i organoid tillväxt och fördubblingstider. Fördubblingstider kan påverka läkemedelssvaren, vilket nyligen diskuterades i ^{litteraturen30}. Om den organoida tillväxthastigheten överstiger det presenterade exemplet avsevärt, kan en kortare expansionstid tills behandlingsstart och kortare behandlingstid övervägas. (4) Dessutom bör särskild försiktighet iakttas vid byte av media för att undvika att man aspirerar organoider. Såddpositionen för BME2 inbäddade organoider vid 6-tidens läge möjliggör en säker aspiration av media när plattorna vrids medurs med 180° och media aspireras i motsatt position av organoiderna. (5) Slutligen är grundlig lys av BME2 inbäddade organoider under överlevnadsavläsningen avgörande för att registrera exakta resultat. Enligt tillverkarens instruktioner ska proverna pipettas upp och ner upprepade gånger, helst med hjälp av ofiltrerade spetsar, för att säkerställa korrekt lys. Inkubationstider ska följas enligt beskrivningen. Dessutom möjliggör överföring av 75% av lysat (istället för den totala volymen) till en vit, ogenomskinlig botten 96-brunnsplatta för den slutliga avläsningen med hjälp av en ELISA-plattläsare en lämplig bedömning, eftersom detta säkerställer samma volym i varje brunn och frånvaron av luftbubblor som kan införas genom kraftig pipettering.

Observera att profilering av läkemedelssvar i BME2-inbäddade organoidkulturer kan visa en högre standardavvikelse än vad som observerats i vanliga cellinjekulturer (figur 2, figur 3A). Den högre standardavvikelsen baseras på flera faktorer, inklusive en ökad sannolikhet för mindre variationer i sådd vid arbete med BME2 och skillnader i individuella organoidtillväxthastigheter över brunnar under den inledande 7-dagars tillväxtperioden. Således bör lika eller mer än fyra tekniska replikat per läkemedelskoncentration sås.

Viktigast av allt, förekomsten av maligna celler som bär på den onkogena föraren mutationen och begränsad förorening av normala luftvägarna epitelial celler måste noggrant utvärderas. Utmaningar i NSCLC etablering kan gynna utväxten av normala luftvägarna epitelial ^celler7. Kopieringsnummer profilering eller PCR- och sekvensering-baserade metoder för att bekräfta förekomsten av de onkogena drivrutin mutationer är de metoder som väljs för att säkerställa kvaliteten på NSCLC organoid kulturer.

Ändringar och felsökning av metoden
Media och respektive tillväxtfaktorer som läggs till grundläggande medielösningar kan ha en betydande inverkan på läkemedelssvaret på riktade hämmare. De aktiverar bypassreceptorer och signalvägar som påverkar och begränsar läkemedelsrespons (t.ex. FGF, HGF, EGF)²⁶. Medan en tillväxtfaktor rika och skräddarsydda medier kan vara optimal för att expandera organoid kultur, bör läkemedelsupptrappning och känslighet bedömningar utföras i en minskad tillväxtfaktor media, som beskrivs ovan. Detta baseras på intern erfarenhet av att jämföra olika medieformuleringar och läkemedelssvarsdata (figur 3C). Medan medielösningar kan påverka graden av känslighet för viss läkemedelsbehandling och kan ändra _IC50-värden , är robusta fenotyper av känslighet eller resistens uppenbara oberoende av medieformulering (figur 3C, D). Dessutom rekommenderas allmän konsekvens i medieformuleringen och profilering av läkemedelssvar mellan organoidkulturer, och en lika eller mer än fyra tekniska replikat per koncentration måste sås. Detta är särskilt viktigt för benchmark-intervall i känslighet kontra. motstånd för den hämmare av intresse.

Metodens begränsningar
Protokollet som presenteras här beskriver känsligheten hos NSCLC 3D cancer organoid modeller till riktade hämmare när patient-härledda cancerceller odlas. Ytterligare experiment, inklusive farmakodynamisk analys avseende väghämning och sekvenseringsanalys för förekomsten av föraren onkogen och sekundära mutationer, behövs för en detaljerad karakterisering av läkemedelsresistens och känslighet. Vidare redovisas inte åskådare faktorer som mikromiljöstimuli som härrör från interaktioner eller utsöndrade faktorer av icke-cancer åskådarceller i tumörmikromiljön, och nya protokoll behövs när samkulturella organoidmodeller med immun- eller stromalceller försöker. Det senaste arbetet har belyst användningen av organoida modeller för att rekapitulera tumör mikromiljö interaktioner och profil svar på immun kontrollpunktshämmare, såsom anti-PD-L1 ^{behandling13,31}.

Metodens betydelse för befintliga/alternativa metoder
3D cancer organoid modeller rekapitulera den genetiska mångfalden och bestämningsfaktorer för behandling svar som finns i den ursprungliga ^tumör4,5,6. I synnerhet kan rumsliga och tidsmässiga heterogenitet främja tumör evolution, och parallella uppkomsten och sekventiell utveckling av tumör subkloner kan ^uppstå32,33. Intratumor heterogenitet är betydande för valet av mer motståndskraftiga tumör celler under terapeutiskt tryck9,34,35. Protokollet som tillhandahålls här möjliggör en snabb bedömning av känsligheter för behandling med riktade hämmare i patientproximatprover. Således har organoida modeller fördelar jämfört med mer konventionella homogena cellinjemodeller som saknar genetisk mångfald eller långsiktiga studier med hjälp av cellinjer eller patientbaserade xenografter. Vidare tillåter det nuvarande protokollet skalning upp till flera armar av behandling och kombinationsbehandlingsmetoder med få begränsningar när det gäller kostnad och analytisk kapacitet. Att lägga till ett andra läkemedel av intresse vid en fast dos samtidigt som den primärt riktade inhibitoren trappas upp och jämförs med eskalering av den främst riktade inhibitoren ensam gör det möjligt att effektivt utvärdera de potentiella kombinatoriska effekterna och med minimal ytterligare biomassa som krävs (kompletterande figur 3). Jämfört med bildframställningsbaserade bedömningar som används för att övervaka organoid utveckling och läkemedelssvar, har den luminiscensbaserade cellöverlevnadsanalysen som beskrivs här liknande känslighet med minimal utrustning och utbildning som krävs.

Metodens betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden
Att utveckla en standardiserad pipeline som gör det möjligt att etablera cancerorganoida modeller från patientprover och den efterföljande läkemedelskänslighetsprofilering har betydande klinisk tillämplighetspotential. Ex vivo farmakologisk profilering har fått erkännande i att upptäcka sårbarheter och resistenta-associerade funktioner i tumörer, korrelerar till behandling svar hos ^{patienter36,37}. Ex vivo profilering av läkemedelskänslighet kan bidra till behandlingsval i kliniken och utformningen av rationella kombinationsbehandlingar som behandlar resistensmekanismer. Sammantaget kan detta tillvägagångssätt bidra till att möjliggöra förbättrade personliga strategier för molekylär terapi eller kombinatoriska behandlingsregimer. Det senare kan bidra till att rikta in sig på mekanismer för läkemedelstolerans och resistens tidigt och fördjupa det kliniska svaret för att förbättra patientens resultat i framtiden.

Materials

1.5 mL tubes
15 mL centrifuge tubes
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane	Corning	430773	for both media
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate	Corning	3904
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate	Corning	3917
A-8301	Tocris Bioscience	293910	for both media
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	for LGM
B27	Life Technologies	12587010	for both media
BioRender 2021	https://biorender.com/		online scientific illustration software
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2)	R&D Systems	353301002
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9682	3D-CTG readout reagent
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes
Deoxyribonuclease I (DNAse I)	ThermoFisher Scientific	18047019
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution	Corning	MT21031CV
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018	for GM
GlutaMax	Gibco	35050061	for LGM
GraphPad Prism software (version 9.2.0)	GraphPad		statistical analysis software
HEPES	Gibco	15630080	for both media
hFGF-10	PeproTech	100-26-100ug	for GM
hFGF-7	PeproTech	100-19-50ug	for GM
hNoggin	PeproTech	120-10C-100ug	for both media
hRspondin	PeproTech	120-38-100ug	for GM
Low retention pipette tips, 20 µL (P20)	ThermoFisher Scientific	2149P-05-HR
Low retention pipette tips, 200 µL (P200)	ThermoFisher Scientific	2069-05-HR
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000)	ThermoFisher Scientific	2179-HR
Multichannel pipette
N-Acetylcysteine	Fisher Scientific	50-424-777	for both media
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636-100G	for both media
Osimertinib	Selleck Checm	S7297
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Gibco	10378016	for LGM
Penicillin/Streptomycin	Cytiva HyClone	SV30010	for GM
Pipettes (different sizes)
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M5	equipment, alternative readers may be used
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	for GM
SB202190	Selleck Chem	S1077	for GM
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021
Vacuum pump and tubing
Vi-CELL XR Cell Analyzer	Beckman Coulter	Vi-CELL XR	cell analyzer / counter