현재 프로토콜은 지속적으로 성장하는 마우스 절개, 마우스 어금니 및 인간 치아로부터 단세포 RNA-seq 분석에 적합한 단일 세포를 격리하는 빠르고 효율적이며 부드러운 방법을 제시합니다.
마우스와 인간의 치아는 단세포 전사 또는 기타 응용 분야를 위한 빠르고 효율적인 세포 격리를 위한 도전적인 기관을 나타냅니다. 세포 외 매트릭스가 풍부한 치과 펄프 조직은 일반적으로 단일 세포 전사학에 대한 합리적인 시간을 초과하는 길고 지루한 해리 과정이 필요합니다. 유전자 발현의 인공적 변화를 피하기 위해, 단일 세포의 분석을 최소화 할 때까지 동물을 안락사에서 경과 시간. 이 작품은 scRNA-seq (단세포 RNA-시퀀싱)에 적합한 우수한 품질로 마우스와 인간의 치아에서 단세포 서스펜션을 얻을 수있는 빠른 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 가속 조직 격리 단계, 효소 소화 및 최종 단일 세포 현탁액의 후속 준비를 기반으로합니다. 이를 통해 조직의 빠르고 부드러운 처리를 가능하게 하며, 생존 가능성이 높고 전사적 변화가 최소화된 세포 현탁액을 얻기 위해 더 많은 동물 또는 인간 샘플을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 또는 인간의 치아뿐만 아니라 연골, 조밀 한 결합 조직 및 진피를 포함한 다른 세포 외 매트릭스가 풍부한 조직에뿐만 아니라 scRNA-seq를 수행하는 데 관심이있는 연구원을 안내 할 수 있습니다.
단세포 RNA 시퀀싱은 생체 내 세포 집단 구조, 계층 구조, 상호 작용 및 항상성1,2에서 해독하기 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그 결과는 강하게 이 진보된 분석의 첫번째 단계에 달려 있습니다 – 복잡하고 잘 조직된 조직에서 완벽한 품질의 단세포 현탁액의 준비. 이것은 세포를 살아 있게 하고 세포의 유전자 발현 단면도에 있는 원치 않는, 인공적인 변경을 방지하는 것을 포함합니다3,4. 이러한 변경은 인구 구조의 부정확한 특성화와 수집된 데이터의 오해로 이어질 수 있습니다.
광범위한 조직에서 격리하기 위한 특정 프로토콜이 개발되었습니다5,6,7,8. 그(것)들은 일반적으로 각종 보철 효소와 추가 잠복과 조합하여 기계적인 해리를 채택합니다. 이들은 전형적으로 트립신, 콜라게나아제, 디스파, papain6,7,8,9, 또는 Accutase, Tryple 등과 같은 상업적으로 이용 가능한 효소 혼합물을 포함합니다. 전사 품질에 영향을 미치는 가장 중요한 부분은 효소 소화입니다. 37°C에서 효소를 통한 장기간 배양이 유전자 발현에 영향을 미치고 많은 스트레스 관련 유전자10,11,12,13의 업레귤레이션을 유발하는 것으로 나타났다. 격리 과정의 다른 중요한 매개 변수는 조직 허혈 114 후에 세포 전사가 변화한다는 것을 보여주었기 때문에 전체 길이입니다. 이 프로토콜은 복잡한 조직에서 세포의 격리를 위한 이전에 이용된 프로토콜인 마우스와 인간 치아에서 단일 세포의 부드러운 절연을 위한 효율적인 프로토콜을 제시합니다5,6,9,11,13,15,16.
이 프로토콜은 단단한 치아에서 연조직을 신속하게 해부하고 scRNA-seq에 적합한 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 하나의 원심 분리 단계를 채택하고 조직 처리 및 소화 시간을 줄이고 조직과 세포를 대부분의 시간 4 °C로 유지함으로써 원치 않는 전사 변화의 효과를 최소화합니다. 절차는 예를 들어 마우스 절개, 어금니 및 인간의 사랑 니에서 세포의 분리를 보여 주지만, 주로 다양한 유기체에서 다른 치아를 위해 작동해야합니다. 전체 프로토콜은 그림 1에서 괄호적으로 시각화됩니다. 이 프로토콜은 최근에 마우스와 인간 치아로부터 얻은 치과 세포 유형 아틀라스를 생성하는 데 사용되어 왔다1.
세포 또는 분자 수준에 치아와 뼈를 공부하는 것은 일반적으로 도전이 조직을 형성하는 세포는 하드 matrices19의 다른 종류에 의해 포위되기 때문에 도전적이다. 치과 조직에 단세포 RNA-seq를 수행하기위한 주요 목표 중 하나는 자신의 전사에 인공 적 변화없이 빠르게 관심의 세포를 얻을 필요가있다. 이를 위해 마우스와 인간 치아 펄프에서 세포를 분리하는 데 적합한 매우 효율적인 프로토콜이 개발되어 모든 전사 응용 분야에 대한 빠른 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있습니다. 이것은 빠른 조직 격리에 의해 보장되었다, 조직 과 세포 조작의 단계를 최소화, 기계적 및 효소 소화를 간소화.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 빠른 조직 처리 및 적당한 단세포 현탁액 준비8,9입니다. 수동 접근 방식은 치과 드릴 이나 다른 열 발생 장치를 활용 하지 않고 치과 펄프를 얻기 위해 사용 됩니다. 과열은 열 충격 단백질 및 기타 유전자의 인공 발현을 일으킬 수 있으며, 궁극적으로 분석된 유전자 발현 패턴이 원래 조직을 대표하지 않게 한다20. 수동 조직 수확 가능성이 사전에 몇 가지 훈련이 필요할 것 이다 도전적인 단계 일 수 있습니다. 펄프는 작은 조각으로 잘라 37 °C에서 효소로 소화된다. 효소 소화의 15-20 분 제외, 전체 프로토콜은 4 °C에서 수행된다. 조직 처리 및 특히 효소 소화는 37°C에서 더 장기간 배양되기 때문에 가능한 한 짧은 시간으로 최소화되어 유전자 발현 패턴10의 변화를 일으킬 수 있다. 효소 소화 전에 덴틴을 기계적으로 제거하는 것이 좋습니다. 덴틴과 펄프 부착 된 predentin은 다량의 콜라겐을 함유하고 있으며 과도한 존재는 소화 용액의 효과를 감소시킬 수 있습니다. 신체에서 제거 된 후 (또는 유기체의 죽음), 세포가 유전자 발현 패턴을 신속하게 수정하기 시작하는 것으로 나타났다12. 따라서 셀 격리 및 처리는 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다. 현재 프로토콜은 조직을 분리하는 것에서 35-45 분으로 처리 시간을 감소시킵니다 (동물 안락사) 단세포 현탁액을 준비하는.
이 기술의 한 가지 대체 수정은 나중에 사용하기 위한 세포 보존입니다. 이것은 메탄올 고정에 의해 달성된다. 메탄올 고정 셀 현탁액은 프로토콜21에 기재된 바와 같이 -80°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있다. 그러나, 가능하면, 메탄올 고정 단세포 현탁액으로부터의 단일 세포 데이터가 스트레스 관련 유전자의 증가발현과 주변 RNA22의 오염으로 고통받을 수 있음을 보여주었기 때문에, 가능한 한 직접 scRNA-seq를 수행한다. 이 단계에서는 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 수정이 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜의 첫 번째 응용 프로그램 전에 기술을 테스트하려면 여러 유효성 검사 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서, 우리는 프로토콜의 전술 한 중요한 단계를 테스트하는 것이 좋습니다. 또한 콜라게나아제 P 용액의 효과를 테스트하고 조직 해리 단계의 처리를 테스트하는 것이 좋습니다. 특히, 콜라게나아제 P 배큐베이션이 개시된 후 처음 5분 정도, 조직의 조각이 함께 집계되어야 한다. 이것은 일반적인 상황입니다. 골재는 1mL 파이펫을 사용하여 3-4분마다 분해되며 시간이 증가하면 거의 보이지 않을 때까지 작아져야 합니다.
더욱이, 원심분리 전 및 필터링 전후의 세포 카운팅 챔버에서 세포 계수를 수행하여 최적이 아닌 초중제 제거로 인한 가능한 세포 손실을 검출하는 것이 좋습니다. 최종 단일 셀 서스펜션을 정화해야 하는 경우 FACS를 사용할 수 있습니다. 세포 선별은 파편이나 죽은 세포를 제거할 뿐만 아니라 형광으로 표지된 셀13,19로 최종 현탁액을 풍부하게 할 수 있게 합니다. 전단 응력이나 셀 선별기의 막힘을 피하기 위해 넓은 노즐(85 μm 또는 100 μm)이 사용됩니다. 이것은 정렬 된 세포의 생존가능성을 더욱 향상시킬 것입니다.
이 기술은 마우스와 인간의 치아 모두에서 설계 및 테스트되었습니다. 주요 제한 인자는 오래된 마우스 (어금니) 및 인간의 치아의 감소 된 치과 펄프에서 세포의 작은 수입니다. 더 많은 수의 세포를 얻을 필요가 있거나 더 오래된 환자의 치아로부터 세포를 획득해야한다고 가정합니다. 한 가지 가능한 해결책은 더 많은 수의 치아를 처리하고 단일 배치로 병합한 후 하나의 샘플로 처리되는 것입니다.
인간 치과 펄프의 살아있는 세포는 콜라게나아제 I와 dispase23의 효소 혼합물을 사용하여 20 년 이상 전에 처음으로 격리되었습니다. 그 이후로 치과 펄프 세포의 격리가 널리 활용되었고, 몇몇 기술은 사용되었습니다5,6,7,8. 여기에 제시된 방법의 중요한 중요성은 scRNA-seq에 대한 최종 세포 현탁액의 높은 품질을 보장하기 위해 격리를 빠르고 부드럽게 만드는 모든 격리 단계의 적응입니다. 더 높은 세포 수율은 효소를 가진 더 긴 배양에 의해 얻어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 단세포 RNA-염기서열에 적합한 품질의 마우스와 인간 치아에서 단일 세포를 신속하게 획득하기 위한 효율적인 솔루션을 제공합니다. 이 기술은 단지 약간의 기술적 수정과 다른 조직이나 유기체에 널리 사용될 것으로 예상된다.
The authors have nothing to disclose.
J.K.는 마사리크 대학의 보조금 기관 (MUNI / H / 1615/2018)에 의해 지원되었으며, 의학 MU 학부에서 주니어 연구원에 이르기까지 자금을 지원받았습니다. J.L.은 마사릭 대학교 보조금 청(MUNI/IGA/1532/2020)의 지원을 받았으며, 브르노 박사 인재 장학금 소지자입니다- 브르노 시 지방자치단체의 자금 지원. T.B. 오스트리아 과학 기금 (리스 마이트너 보조금: M2688-B28)에 의해 지원되었다. 우리는 라이디 이자코비치바 홀라와 베로니카 코바르 마테호바에게 인간의 치아 획득에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 FACS 정렬에 대한 친절한 지원에 대한 라덱 페더와 카렐 수크에게 감사드립니다.
APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |