本文介绍的方法总结了利用细胞外通量分析仪实时测定非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），以评估其细胞生物能量学的优化实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
在稳态条件下，造血干细胞（HSCs）主要处于静息状态，且被认为主要依赖糖酵解来满足其能量需求。然而，在感染或失血等应激条件下，HSCs 会进入增殖状态，并迅速产生下游祖细胞，这些祖细胞进一步分化，最终生成成熟的血细胞。在此转变与分化过程中，HSCs 退出静息状态，并迅速发生代谢转换，从糖酵解转变为氧化磷酸化（OxPHOS）。多种应激条件，如衰老、癌症、糖尿病和肥胖，可能对线粒体功能产生负面影响，从而改变造血过程中 HSCs 及祖细胞的代谢重编程和分化能力。通过检测细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）——分别反映细胞糖酵解和线粒体呼吸的指标——可以获得在正常和应激条件下 HSCs 及祖细胞糖酵解与线粒体功能的宝贵信息。
本文提供了一种详细的实验方案，用于利用细胞外通量分析仪检测小鼠骨髓来源的谱系阴性细胞群体（包括造血干细胞和原始祖细胞，HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）。该方案描述了从小鼠骨髓中分离谱系阴性细胞的方法，阐述了细胞接种密度以及2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，一种抑制糖酵解的葡萄糖类似物）和多种靶向氧化磷酸化（OxPHOS）通路的药物（寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A）在实验中的浓度优化，并介绍了药物处理策略。通过该实验可测定糖酵解通量的关键参数，如基础糖酵解、糖酵解能力及糖酵解储备，以及OxPHOS相关参数，如基础呼吸、最大呼吸、质子泄漏、ATP生成、备用呼吸能力及偶联效率。本方案实现了对非贴壁型HSPCs的ECAR和OCR测定，并可推广应用于优化各类悬浮细胞的分析条件。
引言
造血作用是指由造血干细胞（HSCs）生成具有高度特化功能的各种成熟血细胞的过程1。HSCs 具有自我更新能力，并可分化为多种多能性及谱系特异性的祖细胞群体。这些祖细胞最终产生淋巴系、髓系、红系和巨核细胞系的细胞。为了维持其自我更新能力，HSCs 大多处于静息状态，并且与其他组织干细胞类似，被认为主要依赖糖酵解而非线粒体氧化磷酸化（OxPHOS）来生成 ATP2,3。一旦进入细胞周期，呼吸作用和氧化磷酸化增强，导致活性氧（ROS）水平升高，这不利于 HSC 的维持和功能3。因此，反复的细胞分裂可能导致 HSC 自我更新能力下降，最终导致其耗竭。
在成体造血过程中，造血干细胞（HSCs）主要进行不对称细胞分裂，其中一个子代细胞保留HSC潜能，并继续依赖糖酵解代谢；另一个子代细胞则转变为原始祖细胞，失去自我更新能力，但能够增殖并最终分化为成熟的有功能的造血细胞4。当HSCs分化生成下游祖细胞时，据认为会发生从糖酵解向线粒体代谢的转换，以提供支持这一快速转变所需的能量和生物合成前体5，这一观点得到了以下观察结果的支持：HSCs具有非活性的线粒体质量
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方案
所有脊椎动物实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会批准，并依照该委员会的法规进行。
1. 检测前一天（总时间：约10分钟）
- 传感器盒的水合（步骤时间：约10分钟）
- 打开细胞外通量检测试剂盒，取出传感器盒和辅助板组件。将加样导板平放保存，供次日使用。
- 手动将传感器盒（带盖的上部绿色部分）与辅助板（下方的96孔微孔板）分离，并将其倒置放置在辅助板旁边。
- 使用多通道移液器，向辅助板的每个孔中加入200 µL通量检测试剂盒中附带的校准液。
- 将传感器盒重新放回辅助板上，确保传感器完全浸没在校准液中。
- 将装有校准液的传感器盒与辅助板组件放入无CO2、37 °C的培养箱中过夜。为防止校准液蒸发，需确保培养箱内湿度充足。若使用普通恒温培养箱进行无CO2、37 °C孵育，应在培养箱内放置一个盛有水的敞口烧杯以增加湿度。如有条件，建议使用XF预处理工作站完成所有无CO2、37 °C的孵育步骤。
注意：也可选择在无CO2、37 °C培养箱中，用无菌超纯水每孔200 µL对传感器盒过夜水合。在检测当天，至少在加载注射孔前45–60分钟，将水更换为每孔200 µL、预热至37 °C的校准液。
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结果
通过本方案，优化了细胞数量以及多种靶向氧化磷酸化（OxPHOS）药物的浓度（用于细胞外通量测定），以检测从24周龄雌性C57BL/6小鼠中分离得到的造血干细胞和祖细胞（HSPC）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）。首先进行糖酵解压力测试，以优化细胞数量和寡霉素（oligomycin）浓度。本实验中每孔使用的HSPC数量范围为5 × 104 至 2.5 × 105。如图2A和图2C所示，非糖酵解性酸化速率随着细胞数量从5 × 104增加到2.5 × 105而上升，但在2 × 105至2.5 × 105细胞之间仅轻微增加。正如预期，加入10 mM葡萄糖在所有细胞数量下均刺激了糖酵解反应，且每孔2.5 × 105个细胞时ECAR达到最大增幅。然而，加入2 μM寡霉素并未进一步增加ECAR，这与预期结果不符。使用1 μM寡霉素也得到类似结果（未显示）。这些结果提示.......
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讨论
本文介绍了一种利用Seahorse细胞外通量分析仪优化的小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）细胞生物能量代谢（糖酵解和氧化磷酸化）评估方案。该仪器是一种强大的工具，可同时测量活细胞的胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），分别作为糖酵解和线粒体呼吸的指标，从而实现实时监测细胞生物能量状态。此外，基于96孔微孔板的平台具有高通量和高灵敏度的优势，可在单块微孔板上同时分析多个样本；相比之下，另一种高分辨率呼吸测定仪Oroboros O2k仅能同时分析2个样本，而传统的Clark电极20则通量更低。
细胞外通量分析仪主要用于贴壁细胞类型的分析，因其要求细胞以单层形式存在，这使得对悬浮培养的细胞进行分析更具挑战性。此外，在通过加药孔注入药物后，药物与培养基在检测孔内混合过程中会产生湍流，可能导致细胞从孔底脱落。因此，细胞必须牢固地贴附于孔的底部。本方案中采用了一种来源于海洋贻贝Mytilus edulis的非免疫原性多酚蛋白制成的细胞黏附剂，以制备小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的贴壁单层细胞。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
Lombard实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（NIGMS R01GM101171，NIEHS R21ES032305）、美国国防部（DoD）（CA190267、CA170628、NF170044和ME200030）以及格伦医学研究基金会的支持。李实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（NHLBI 5R01HL150707）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 滤膜 | Corning | 430626 | 用于过滤除菌检测培养基 |
| 100 mM 丙酮酸钠 | Life Technologies | 11360-070 | 线粒体应激检测培养基的组分 |
| 15 mL 圆锥形 Falcon 管 | Corning | 352096 | 用于造血干细胞与祖细胞（HSPCs）收获及检测药物溶液配制 |
| 200 mM L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030-081 | 糖酵解应激检测和线粒体应激检测培养基的组分 |
| 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG） | Sigma-Aldrich | D8375 | 糖酵解应激检测中的第三次药物注射 |
| 5x 富集缓冲液（MojoSort） | Biolegend | 480017 | 用于 HSPCs 收获过程中的洗涤 |
| 氯化铵（NH4Cl） | Fisher Scientific | A661-3 | ACK 裂解缓冲液的组分 |
| 抗霉素 A | Sigma-Aldrich | A8674 | 线粒体应激检测中的第三次药物注射 |
| Bio-Rad DC 蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 500-0112 | 按制造商说明书使用 |
| 羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP） | Sigma-Aldrich | C2920 | 线粒体应激检测中的第二次药物注射 |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | 细胞黏附剂，用于细胞微孔板的包被 |
| Countes 3 全自动细胞计数仪 | ThermoFisher Scientific | 用于细胞计数 | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | ACK 裂解缓冲液和 RIPA 裂解缓冲液的组分 |
| Falcon 70 μm 滤膜 | Fisher Scientific | 08-771-2 | 用于 HSPCs 收获过程中的细胞过滤 |
| Gibco 胎牛血清（FBS） | Fisher Scientific | 26400044 | 用于 HSPCs 收获过程中检测缓冲液的配制 |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | 用于 HSPCs 收获过程中检测缓冲液的配制 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7528 | 线粒体应激检测培养基的组分，以及糖酵解应激检测中的首次注射 |
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | O4876 | 糖酵解应激检测中的第二次药物注射，以及线粒体应激检测中的首次药物注射 |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | 用于检测后细胞洗涤以进行蛋白定量 |
| 碳酸氢钾（KHCO3） | Fisher Scientific | P235-500 | ACK 裂解缓冲液的组分 |
| 蛋白酶抑制剂混合物（PIC） | Roche | 11836170001 | 以片剂形式提供。每片溶于 10 mL RIPA 缓冲液中，配制成 1x PIC。 |
| 大鼠生物素标记抗小鼠 B220 抗体，克隆编号：RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| 大鼠生物素标记抗小鼠 CD2 抗体，克隆编号：RM2-5 | Biolegend | 100103 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| 大鼠生物素标记抗小鼠 CD3 抗体，克隆编号：17A2 | Biolegend | 100243 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| 大鼠生物素标记抗小鼠 CD5 抗体，克隆编号：53-7.3 | Biolegend | 100603 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| 大鼠生物素标记抗小鼠 CD8 抗体，克隆编号：53-6.7 | Biolegend | 100703 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| 大鼠生物素标记抗小鼠 Gr-1 抗体，克隆编号：RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| 大鼠生物素标记抗小鼠 Ter-119 抗体，克隆编号：TER-119 | Biolegend | 116203 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | 线粒体应激检测中的第三次药物注射 |
| Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪 | Seahorse Biosciences（现为 Agilent） | 用于实时测量 ECAR 和 OCR。 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | 用于配制微孔板包被用细胞黏附溶液 |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher | BP358 | RIPA 裂解缓冲液的组分 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | RIPA 裂解缓冲液的组分 |
| 氟化钠（NaF） | Sigma-Aldrich | S7920 | RIPA 裂解缓冲液的组分 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | S8045 | 配制成 1 N 溶液，用于 pH 值调节 |
| 链霉亲和素纳米磁珠（MojoSort） | Biolegend | 480015 | 用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭 |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | RIPA 裂解缓冲液的组分 |
| XF 基础培养基 | Agilent | 102353-100 | 用于配制糖酵解应激检测和线粒体应激检测培养基的基础培养基 |
| XF 预处理工作站 | Seahorse Biosciences | 用于非 CO2 条件下 37 °C 的孵育 | |
| XFe96 细胞外通量检测试剂盒 | Agilent | 102416-100 或 102601-100 | 包含检测用微孔板、辅助板、加样导板（用于向检测微孔板中加样 药物）、XF 校准液以及 XF 细胞培养微孔板 |
参考文献
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019
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