Medición de la capacidad de importación de proteínas de las mitocondrias del músculo esquelético
Summary
Las mitocondrias son orgánulos metabólicos clave que exhiben un alto nivel de plasticidad fenotípica en el músculo esquelético. La importación de proteínas del citosol es una vía crítica para la biogénesis de orgánulos, esencial para la expansión del retículo y el mantenimiento de la función mitocondrial. Por lo tanto, la importación de proteínas sirve como un barómetro de la salud celular.
Abstract
Las mitocondrias son orgánulos metabólicos y reguladores clave que determinan el suministro de energía, así como la salud general de la célula. En el músculo esquelético, las mitocondrias existen en una serie de morfologías complejas, que van desde pequeños orgánulos ovalados hasta una amplia red similar a un retículo. Comprender cómo el retículo mitocondrial se expande y se desarrolla en respuesta a diversos estímulos, como las alteraciones en la demanda de energía, ha sido durante mucho tiempo un tema de investigación. Un aspecto clave de este crecimiento, o biogénesis, es la importación de proteínas precursoras, originalmente codificadas por el genoma nuclear, sintetizadas en el citosol y translocadas en varios subcompartimentos mitocondriales. Las mitocondrias han desarrollado un mecanismo sofisticado para este proceso de importación, que involucra muchos canales selectivos de membrana interna y externa, conocidos como la maquinaria de importación de proteínas (PIM). La importación a la mitocondria depende del potencial de membrana viable y de la disponibilidad de ATP derivado de orgánulos a través de la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, su medición puede servir como una medida de la salud de los orgánulos. El PIM también exhibe un alto nivel de plasticidad adaptativa en el músculo esquelético que está estrechamente acoplado al estado energético de la célula. Por ejemplo, se ha demostrado que el entrenamiento con ejercicios aumenta la capacidad de importación, mientras que el desuso muscular la reduce, coincidiendo con los cambios en los marcadores de contenido mitocondrial. Aunque la importación de proteínas es un paso crítico en la biogénesis y expansión de las mitocondrias, el proceso no está ampliamente estudiado en el músculo esquelético. Por lo tanto, este documento describe cómo utilizar mitocondrias aisladas y completamente funcionales del músculo esquelético para medir la capacidad de importación de proteínas con el fin de promover una mayor comprensión de los métodos involucrados y una apreciación de la importancia de la vía para el recambio de orgánulos en el ejercicio, la salud y la enfermedad.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos que existen en morfologías complejas en diferentes tipos de células y se reconoce que poseen una gama cada vez mayor de funciones que son críticas para la salud celular. Como tales, ya no pueden reducirse simplemente a orgánulos productores de energía. Las mitocondrias son reguladores metabólicos clave, determinantes del destino celular y centros de señalización, cuyas funciones pueden servir como indicadores útiles de la salud celular en general. En las células musculares esqueléticas, los estudios de microscopía electrónica revelan la presencia de mitocondrias subsarcolemmales (SS) e intermiofibrilares (IMF) geográficamente distintas, que exhiben un grado de conectividad1,2,3,4 que ahora se reconoce que es altamente dinámico y adaptable a los cambios en los niveles de actividad del músculo esquelético, así como con la edad y la enfermedad. El contenido mitocondrial y la función en el músculo pueden evaluarse de numerosas maneras5,6, y se han aplicado métodos tradicionales de aislamiento de orgánulos para comprender mejor las capacidades respiratorias y enzimáticas (Vmax) de las mitocondrias distintas de la influencia del medio celular7,8. En particular, estos métodos tradicionales han revelado sutiles distinciones bioquímicas entre mitocondrias aisladas de regiones subsarcolemmales e intermiofibrilares, desmintiendo posibles implicaciones funcionales para el metabolismo en estas regiones subcelulares8,9,10,11.
La biogénesis de las mitocondrias es única en requerir la contribución de productos genéticos del ADN nuclear y mitocondrial. Sin embargo, la gran mayoría de estos se derivan del núcleo, ya que la transcripción del ADNmt solo conduce a la síntesis de 13 proteínas. Dado que las mitocondrias normalmente comprenden >1000 proteínas involucradas en diversas vías metabólicas, la biogénesis del orgánulo requiere un medio estrechamente regulado de importación y ensamblaje de proteínas precursoras del citosol en los diversos subcompartimentos mitocondriales para mantener una estequiometría y función adecuadas12,13. Las proteínas codificadas nuclearmente destinadas a las mitocondrias normalmente llevan una secuencia de orientación mitocondrial (MTS) que las dirige al orgánulo y facilita su localización subcompartimental. La mayoría de las proteínas unidas a la matriz contienen un MTS N-terminal escindible, mientras que las destinadas a la membrana mitocondrial externa o interna suelen tener dominios de orientación internos14. El proceso de importación se lleva a cabo mediante un conjunto de canales diversos que proporcionan múltiples vías de entrada en el orgánulo13. La translocasa del complejo de membrana externa (TOM) transporta precursores desde el citosol hacia el espacio intermembrana, donde son reconocidos por la translocasa del complejo de membrana interna (TIM). Este complejo es responsable de importar precursores codificados nuclearmente a la matriz, donde las proteasas escinden la presecuencia de apuntamiento N-terminal. Las proteínas destinadas a la membrana externa se pueden insertar directamente en esta membrana a través del complejo TOM, mientras que las destinadas a la membrana interna se insertan mediante una proteína TIM, específicamente TIM22. Después de su importación, las proteínas son procesadas por proteasas y chaperonas residentes y, a menudo, se combinan para formar complejos más grandes, como los que se encuentran en la cadena de transporte de electrones.
La importación de proteínas mitocondriales en sí misma también sirve como una medida de la salud mitocondrial, ya que este proceso se basa en la presencia de potencial de membrana y una fuente de energía en forma de ATP15. Por ejemplo, cuando el potencial de membrana se disipa, la proteína quinasa PINK1 no puede ser absorbida por el orgánulo, y esto conduce a señales de fosforilación que desencadenan el inicio de la degradación del orgánulo a través de una vía llamada mitofagia16,17. En circunstancias similares, cuando se impide la importación, la proteína ATF5 no puede entrar en el orgánulo, y posteriormente se transloca al núcleo, donde sirve como factor de transcripción para la regulación ascendente de la expresión génica UPR18,19. Por lo tanto, medir la eficiencia de la importación de proteínas puede proporcionar una visión completa de la salud del orgánulo, mientras que la respuesta de expresión génica se puede utilizar para indicar el grado de señalización retrógrada al núcleo.
A pesar de su obvia importancia para la biogénesis de las mitocondrias y para la salud celular en general, la vía de importación en las mitocondrias de los mamíferos está notablemente poco estudiada. En este informe, describimos los pasos específicos involucrados en la medición de la importación de proteínas precursoras en las mitocondrias del músculo esquelético y proporcionamos datos para ilustrar la respuesta adaptativa del sistema de importación a los cambios en el músculo y el desuso, ilustrando la contribución de la importación de proteínas a la plasticidad adaptativa del músculo esquelético.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las mitocondrias dependen exclusivamente de la expresión y coordinación de los genomas nuclear y mitocondrial para su síntesis y expansión dentro de las células. Sin embargo, el genoma nuclear codifica la gran mayoría (99%) del proteoma mitocondrial, y esto subraya la importancia de la maquinaria de importación de proteínas para apoyar la biogénesis mitocondrial. La importación también sirve como un evento de señalización importante, ya que la falta de importación puede promover el inicio de la respuesta de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. G.C. Shore de la Universidad McGill, al Dr. A. Strauss de la Escuela de Medicina de Washington y al Dr.M.T. Ryan de la Universidad de La Trobe por las donaciones originales de plásmidos de expresión que se utilizaron para esta investigación. Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a D. A. Hood. D. A. Hood también es titular de una Cátedra de Investigación de Canadá en Fisiología Celular.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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