Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

Summary

O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.

Abstract

A necessidade de métodos reprodutíveis, porém tecnicamente simples, que produzam cardiomiócitos de alta qualidade é essencial para a pesquisa em biologia cardíaca. Experimentos funcionais celulares e moleculares (por exemplo, contração, eletrofisiologia, ciclagem de cálcio, etc.) em cardiomiócitos são o padrão-ouro para estabelecer mecanismo(s) de doença. O camundongo é a espécie de escolha para experimentos funcionais e a técnica descrita é específica para o isolamento de cardiomiócitos de camundongos. Métodos anteriores que requerem um aparelho de Langendorff requerem altos níveis de treinamento e precisão para a canulação aórtica, muitas vezes resultando em isquemia. O campo está mudando para métodos de isolamento livres de Langendorff que são simples, são reprodutíveis e produzem miócitos viáveis para aquisição de dados fisiológicos e cultura. Esses métodos diminuem muito o tempo de isquemia em relação à canulação aórtica e resultam em cardiomiócitos obtidos de forma confiável. Nossa adaptação ao método livre de Langendorff inclui uma perfusão inicial com solução de limpeza gelada, uso de uma plataforma estabilizadora que garante uma agulha estável durante a perfusão e etapas adicionais de digestão para garantir cardiomiócitos obtidos de forma confiável para uso em medidas funcionais e cultura. Este método é simples e rápido de executar e requer pouca habilidade técnica.

Introduction

Há décadas, uma ideia essencial na literatura de biologia cardíaca é o mecanismo molecular de ação. O mecanismo de ação deve ser estabelecido para a publicação de estudos confiáveis. Uma estratégia bem estabelecida para determinar o mecanismo molecular são os estudos isolados de cardiomiócitos, que requerem cardiomiócitos de alta qualidade para a obtenção de dados confiáveis. Experimentos celulares e moleculares realizados em cardiomiócitos para determinar o mecanismo de ação são o padrão-ouro para investigar contração¹, eletrofisiologia², ciclagem de cálcio (Ca²+)³, miofilamento Ca²⁺ sensibilidade⁴, citoesqueleto⁵, metabolismo⁶, efeitos de hormônios⁷, moléculas sinalizadoras⁸, estudos de fármacos⁹ etc. O camundongo tornou-se a espécie de escolha para a maioria dos experimentos de biologia cardíaca devido à facilidade de manipulação genética, seu pequeno tamanho, sua vida útil relativamente curta, baixo custo, etc¹⁰. No entanto, o isolamento confiável de cardiomiócitos de camundongos de alta qualidade não é trivial com as técnicas atuais.

Os laboratórios vêm isolando cardiomiócitos há quase 70 anos¹¹. Praticamente todas as técnicas para isolar cardiomiócitos dependem da digestão do coração através de várias enzimas (colagenase, protease, tripsina, etc.). Nos primeiros períodos (décadas de 1950-1960), foi empregado o método chunk, que envolvia a remoção do coração, o corte em pedaços bem menores e a incubação em solução com colagenase/protease/tripsina¹². Na década de 1970, os laboratórios implementaram o método de “Langendorff”^melhorado13, que isolava cardiomiócitos usando uma técnica de isolamento baseada na perfusão coronariana (perfusão retrógrada com enzima via aparelho de Langendorff); Esta técnica continua sendo o método dominante de isolamento de miócitos no campo hoje, ~50 anos depois^14,15,16. Trabalhos recentes passaram a cularizar o coração in vivo para limitar o tempo de hipóxia e o dano isquêmico, resultando em isolamentos superiores de cardiomiócitos (melhor rendimento e maior qualidade)¹⁷. Recentemente, este evoluiu para a realização in vivo de perfusões cardíacas livres de Langendorff 18,19,20,21,22. Evoluímos a técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff baseada na técnica de Ackers-Johnson et ^al.18 e adaptamos vários componentes das várias técnicas de isolamento anteriores. Essas principais adaptações incluem a injeção de um tampão de limpeza gelado e a incorporação de uma plataforma de suporte para estabilizar a agulha, permitindo a diminuição da manipulação do coração. Também é detalhado nessa técnica o controle da temperatura dos tampões injetados (37 °C), que diminuiu o tempo entre a injeção in vivo e a digestão devido à menor perfusão com EDTA, como publicado anteriormente¹⁸. Diminuindo a manipulação do coração e, portanto, minimizando o tamanho do local de punção, obtém-se perfusão completa e constante das artérias coronárias. Também refinamos a técnica com um método secundário de digestão, a quantidade de EDTA no tampão de limpeza injetado e mudamos o pH. Nossa técnica descrita é mais confiável, mais eficiente e não requer treinamento/prática extensiva em comparação com o uso do aparelho de Langendorff (Tabela 1).

Protocol

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Ohio State University, de acordo com as diretrizes do NIH. 1. Preparação da solução NOTA: Consulte o quadro 2 para as concentrações de tampão. Pré-isolamento (até 2 semanas antes do isolamento do miócito)Base tampão de perfusão: Preparar 1 L de base tampão de perfusão (NaCl, KCl, N…

Representative Results

Há alguns elementos a serem examinados ao determinar o sucesso de um isolamento. Primeiro, os cardiomiócitos devem ser em forma de bastonete, sem bolhas de membrana, como as células isoladas na Figura 1. Um isolamento típico produzirá ~80% dos miócitos em forma de bastonete. Se o isolamento produzir algo menos do que 50% de células em forma de bastonete, então é considerado um isolamento malsucedido e cardiomiócitos não são usados. Por fim, os cardiomiócitos devem ser quiescente…

Discussion

A principal vantagem de nossa técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff é que ela limita a hipóxia e o tempo de isquemia por não necessitar de canulação para um aparelho de Langendorff. Alternativamente às técnicas clássicas de Langendorff que levam vários minutos para remover, limpar e pendurar o coração, muitas vezes resultando em dano isquêmico ao miócito, nosso método inclui uma limpeza in vivo do sangue por meio de uma solução de limpeza gelada. O tampão de limpeza …

Materials

10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815