Усиление парамагнитной релаксации для обнаружения и характеристики самоассоциаций внутренне неупорядоченных белков

Summary

Представлен протокол применения ЯМР-спектроскопии с усилением парамагнитной релаксации для выявления слабых и переходных меж- и внутримолекулярных взаимодействий в внутренне неупорядоченных белках.

Abstract

Внутренне неупорядоченные белки и внутренне неупорядоченные участки внутри белков составляют большую и функционально значимую часть протеома человека. Высокая гибкость этих последовательностей позволяет им формировать слабые, дальние и переходные взаимодействия с различными биомолекулярными партнерами. Специфические, но низкоаффинные взаимодействия способствуют беспорядочному связыванию и позволяют одному внутренне неупорядоченному сегменту взаимодействовать с множеством целевых сайтов. Из-за переходного характера этих взаимодействий их может быть трудно охарактеризовать методами структурной биологии, которые полагаются на белки для формирования единой, преобладающей конформации. ЯМР с усилением парамагнитной релаксации является полезным инструментом для идентификации и определения структурных основ слабых и переходных взаимодействий. Описан подробный протокол использования усиления парамагнитной релаксации для характеристики малонаселенных комплексов встреч, которые образуются между внутренне неупорядоченными белками и их белком, нуклеиновой кислотой или другими биомолекулярными партнерами.

Introduction

Внутреннее расстройство (ID) описывает белки (IDP) или области внутри белков (IDR), которые не спонтанно сворачиваются в стабильные вторичные или третичные структуры, но являются биологически активными. Как правило, функция IDP/IDR заключается в содействии специфическим, но обратимым взаимодействиям с биомолекулами в физиологических^{условиях1}. Таким образом, IDP и IDR участвуют в ряде клеточных функций, включая рекрутирование, организацию и стабилизацию мультибелковых комплексов, например, сборку и активность сплайсосомы², рекрутирование и организацию компонентов в сайтах повреждения ДНК³, организацию и стабилизацию рекрутирования транскрипционных комплексов⁴ или хроматинового ремоделера BAF⁵. Кроме того, IDP обнаруживаются в сигнальных нексусах, где их беспорядочные связи с различными партнерами по связыванию позволяют им опосредуть передачу информации через клеточные белковые^сети. Недавние работы также выявили склонность областей IDR к самоассоциированию, образуя биомолекулярные конденсаты в процессе разделения фаз жидкость-жидкость⁷. В настоящее время считается, что многие из вышеупомянутых функций, связанных с ИД, также включают в себя некоторый аспект образования конденсата⁸. Несмотря на важность ИД для сборки, стабилизации, скаффолдинга и передачи сигналов биомолекулярных комплексов, атомные детали их специфических взаимодействий трудно идентифицировать, поскольку IDP и IDR обычно не поддаются структурным исследованиям с использованием рентгеновской кристаллографии или криогенной электронной микроскопии.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) является идеальным методом для исследования ИД, поскольку он не зависит от наличия жестких или однородных структурных ансамблей, а сообщает о непосредственном локальном окружении отдельных ядер. Резонансная частота, или химический сдвиг, ядра в данной молекуле зависит от слабых магнитных полей, индуцированных локальным распределением электронов, которое, в свою очередь, зависит от длины связи, углов, близости других ядер, взаимодействия с партнерами по связыванию и^{других факторов.} Таким образом, каждое ядро действует как уникальный, сайт-специфичный структурный зонд, чувствительный к изменениям в своей локальной химической среде. Несмотря на эти преимущества, ЯМР является массовым методом, и наблюдаемый химический сдвиг является средним значением для всех сред, отобранных конкретным ядром. Был разработан ряд методов ЯМР, многие из которых описаны в этом выпуске, для восстановления структурной, динамической и кинетической информации о высокоэнергетических, малонаселенных биомолекулярных конформациях, содержащихся в усредненном химическом сдвиге^10,11. Несмотря на то, что эти состояния временно заселены, их идентификация и количественная оценка важны для определения деталей функциональных механизмов¹². Например, в случае IDP и IDR конформационный ансамбль может быть смещен в сторону преимущественного отбора конформаций, продуктивных для формирования комплексов встреч с физиологическими партнерами по связыванию. Обнаружение этих состояний, а также идентификация меж- и внутримолекулярных взаимодействий и динамики, специфичных для остатков, важны для определения основных структурных механизмов функционирования белков и образования комплексов.

Описан протокол использования ЯМР с усилением парамагнитной релаксации (PRE) для исследования переходных, малонаселенных состояний, важных для формирования IDP/IDR-опосредованных биомолекулярных комплексов¹³. Этот подход полезен для изучения транзиторных белок-белковых взаимодействий, таких как те, которые способствуют сборке амилоидных фибрилл из α-синуклеина 14,15 или самоассоциации FUS¹⁶, а также для характеристики специфических белок-белковых взаимодействий^, таких как между сигнальными белками¹⁷. Представлен пример самоассоциативного IDP, в котором специфические меж- и внутримолекулярные взаимодействия приводят к преимущественно компактным состояниям, а также сайт-специфичным взаимодействиям, которые управляют самоассоциацией.

PRE возникает в результате магнитного дипольного взаимодействия ядра с парамагнитным центром с изотропным g-тензором, обычно поставляемым в виде неспаренного электрона на нитроксидной группе или в виде парамагнитного атома металла¹⁸ (рис. 1). В то время как атомы с анизотропными g-тензорами также производят эффект PRE, анализ этих систем более сложен из-за искажающих эффектов, вносимых псевдоконтактными сдвигами (PCS) или остаточной дипольной связью (RDC)^13,19. Сила взаимодействия между ядром и парамагнитным центром зависит от расстояния <^r-6> между ними. Это взаимодействие приводит к увеличению скоростей ядерной релаксации, что приводит к обнаруживаемому уширению линии даже для дальних взаимодействий (~10-35 Å), поскольку магнитный момент неспаренного электрона очень силен^20,21. Детектирование переходных состояний с помощью PRE возможно при соблюдении следующих двух условий; (1) переходное взаимодействие происходит в быстром обмене на временной шкале ЯМР (наблюдаемый химический сдвиг представляет собой средневзвешенное по популяции значение состояний обмена); и (2) расстояние между ядрами и парамагнитным центром короче в переходно-населенном состоянии, чем в основном состоянии¹¹. Поперечная ПЭ обозначается Γ₂ и для практических целей вычисляется по разности скоростей поперечной релаксации ^{в 1}Н между образцом, содержащим парамагнитный центр, и диамагнитным регулятором. Для углубленного рассмотрения теории PRE и связанных с ней псевдоконтактных сдвигов в режимах быстрого и медленного обмена читатель может обратиться к подробным обзорам Клора и его коллег^13,22. Здесь рассматривается только ситуация, когда ¹H N-Γ₂ находится в режиме быстрого обмена, где ^{из-за r-6-зависимости} PRE наблюдаемая скорость релаксации связана как с расстоянием, на которое парамагнитный центр приближается к ядру, так и с количеством времени, которое он проводит в этой конформации. Таким образом, переходные конформации, не предполагающие близкого сближения, приводят к малому PRE, в то время как более тесные взаимодействия, даже если они кратковременны, приведут к большему PRE.

Для IDP PRE используется для измерения и дифференциации взаимодействий, происходящих внутри одной молекулы (внутримолекулярное) и между отдельными молекулами (межмолекулярное). Прикрепив парамагнитный центр к видимому (например, ¹⁵N-меченному) или невидимому (например, природному изобилию ¹⁴N) белку, можно определить источник (меж- или внутримолекулярный) PRE (рис. 2). Сайт-направленный мутагенез, при котором вводится остаток цистеина, является удобным подходом для присоединения парамагнитного центра (спин-метки) к белку²³. Несколько типов молекул были предложены для использования в качестве спиновых меток, в том числе хелатирующие (на основе ЭДТА) и свободнорадикальные (на основе нитроксида)²⁴. Были описаны различные спиновые метки нитроксида, которые доступны с различными химически активными химическими веществами, такими как метанетиосульфонат, малеимид и йодоацетамид^25,26 (рис. 1). Гибкость, присущая метке или линкеру, может быть проблематичной для некоторых анализов, и в этих ситуациях были предложены различные стратегии для ограничения движения метки, такие как добавление громоздких химических групп или использование второго линкера для привязки метки к белку (прикрепление двух сайтов)^{27. 28}. См. Кроме того, коммерчески доступные метки могут содержать диастереомерные белки, но, как правило, это не способствует наблюдаемому PRE²⁹. Описано использование 3-Малеймидо-ПРОКСИЛА, присоединенного к свободному цистеину с помощью химии малеимида, поскольку он легко доступен, экономически эффективен, необратим, а восстановитель трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТЦЭП) может сохраняться в растворе на протяжении всей реакции мечения. Поскольку 3-Малеймидо-ПРОКСИЛ имеет изотропный g-тензор, ПКС или РДК не индуцируются, и одни и те же назначения химического сдвига могут быть использованы как для парамагнитных, так и для диамагнитных образцов¹³.

¹H_{N-T 2} измеряется с использованием стратегии двух временных точек (T _a, T_b), которая, как было показано ранее, столь же точна, как и сбор полного ряда эволюции, состоящего из 8-12 временных точек³⁰. Первая временная точка (T _a) устанавливается как можно ближе к нулю, а оптимальная длина второй временной точки зависит от величины наибольшего ожидаемого PRE для данного образца и может быть оценена по формуле: T_b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2), где R _2,dia представляет R ₂ диамагнитного образца¹³. Если величина наибольших PRE неизвестна, установка T_b в ~ 1 раз больше ¹H T2 белка является хорошей начальной оценкой и в дальнейшем оптимизируется путем корректировки _T2 для улучшения соотношения сигнал/шум. Эта двухточечная стратегия измерения значительно сокращает экспериментальное время, необходимое для измерения PRE, и дает время для большего усреднения сигнала, особенно с учетом того, что для минимизации эффектов неспецифических контактов между молекулами используются относительно разбавленные образцы. Последовательность импульсов на основе HSQC используется для измерения ¹H N-T₂ и была подробно описана в другом месте³⁰. Для повышения чувствительности жесткие импульсы прямой и обратной передач INEPT могут быть заменены фигурными импульсами; в качестве альтернативы последовательность легко преобразуется в считывание на основе TROSY³¹. Поскольку IDP, как правило, имеют гораздо более длительную скорость поперечной релаксации, что приводит к более узкой ширине линии (из-за присущего им беспорядка), чем глобулярные белки аналогичного размера, длительное время регистрации в косвенном измерении может быть использовано для улучшения спектрального разрешения и смягчения ограничения дисперсии химического сдвига, присущего IDP.

PRE является полезным инструментом для изучения белок-белковых и белок-нуклеиновых кислот, особенно переходных или малонаселенных. Представлен подробный протокол подготовки образца ЯМР, пригодного для измерения ПРЭ, включая этапы очистки белка, сайт-ориентированного спинового мечения, настройки и калибровки импульсной программы, обработки и интерпретации данных ЯМР. В работе отмечаются важные экспериментальные соображения, которые могут повлиять на качество данных и исход эксперимента, включая концентрацию образца, выбор спиновой метки и удаление парамагнитных компонентов.

Protocol

Общие требования к протоколу: оборудование для очистки белков, УФ-ВИД спектрометр, высокопольный ЯМР-спектрометр и операционное программное обеспечение, в том числе программное обеспечение для анализа постобработки; NMRPipe32, Sparky 33 (или CCPN Analysis 34, или NMRViewJ35).<sup class=…

Representative Results

Внутримолекулярные 1H N-Γ2 PRE регистрировали на самоассоциирующем, внутренне неупорядоченном фрагменте (остатки 171-264), полученном из домена низкой сложности РНК-связывающего белка EWSR142 (рис. 3). Ожидается, что остатки, находящиеся в непос?…

Discussion

Представлен метод характеристики переходных взаимодействий, существующих в малых популяциях между внутренне неупорядоченными белками и различными партнерами связывания с использованием PRE. В показанном примере белок является самоассоциативным, и, таким образом, PRE может возникать в …

Materials

0.45 µm and 0.22 µm syringe filters	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.
100 mm Petri Dish	Fisher	FB0875713	Agar plates for bacterial transformation.
14N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	576794	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
15N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	299251	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
3 L Fernbach baffled flask	Corning	431523	Bacterial expression culture
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Nitroxide spin label
50 mL conical centrifuge tubes	Thermo Fisher	14-432-22	Solution/protein storage
Amicon centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC900308	Protein concentration
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid
Analytical balance	Oahus	30061978	Explorer Pro, for weighing reagents
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	AX1775	Reduces nitroxide spin label
Autoclave			Sterilize glassware and culture media
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901	M9 media component
Centrifuge bottles	Thermo Fisher	010-1459	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Centrifuge, hand-crank	Thomas Scientific	0241C68	Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions
Computer workstation			Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky
Deuterium oxide	Sigma Aldrich	151882	Needed for NMR lock signal
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	M9 media component
Dibasic Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	S5136	M9 media component
Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)	Thermo Fisher	22582	Quantification of free cystiene residues
High speed centrifuge tubes	Thermo Fisher	3114-0050	Used to clear bacterial lysate.
High-field NMR instrument (600 – 800 MHz)	Bruker		Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control
IMAC column, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Initial fractionation of crude bacterial lysate
Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Induces protein expression for genes under control of lac operator
LB agar	Thermo Fisher	22700025	Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.
LB broth	Thermo Fisher	12780052
Low-pressure chromatography system	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M7506	M9 media component
Medium pressure chromatography system	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector
MEM vitamin solution	Sigma Aldrich	M6895	M9 media component
Microfluidizer	Avestin	EmulsiFlex-C3	Provides rapid and efficient bacterial cell lysis
Micropipettes	Thermo Fisher		Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)
Monobasic potassium phosphate	Sigma Aldrich	1551139	M9 media component
NMR pipettes	Sigma Aldrich	255688	To remove sample from NMR tube
NMR sample tube	NewEra	NE-SL5	Suitable for high-field NMR spectrometers
Preparative Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Round bottom polystyrene centrifuge tubes	Corning	352057	Clear bacterial lysate
Shaking incubator	Eppendorf	S44I200005	Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886	M9 media component
Sonicating water bath and vacuum source	Thomas Scientific		Used to degas buffer solutions
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA
Spectrophotometer	Implen	OD600 Diluphotometer	Monitor growth of E.coli protein expression cultures
Superdex 200 16/600 size exculsion colum	Cytvia	28989333	Final protein purification step
Topspin software, version 3.2 or later	Bruker		Operating software for the NMR instrument
Transformation competent E. coli cells	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	ThermoFisher	20490	Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations
UV-Vis spectrophotometer	Implen	NP80	Measure protein concentration.
Water bath, temperature controlled	ThermoFisher	FSGPD25	For heat shock step of bacterial transformation
Yeast extract	Sigma Aldrich	Y1625	For supplementing M9 media if required