Method Article

ナノ粒子追跡解析における細胞外小胞の研究のための最小限の情報を満たす再現性の向上2018ガイドライン

DOI:

10.3791/63059

⸱

November 17th, 2021

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1Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

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ナノ粒子追跡分析(NTA)は、細胞外小胞を特徴付けるために広く使用されている方法です。この論文では、NTAの実験パラメータと対照に加えて、実験室間の再現性のためにMISEV2018とEV-TRACKによって提案されたガイドラインを補完するために必要なサンプルと希釈剤の均一な分析と特性評価方法に焦点を当てます。

Abstract

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ナノ粒子追跡解析(NTA)は、2006年以来、細胞外小胞(EV)研究に使用されているいくつかの特性評価方法の1つです。多くの人は、NTA機器とそのソフトウェアパッケージは最小限のトレーニングで簡単に利用でき、サイズ校正は社内で実現可能であると考えています。NTA取得とソフトウェア解析の両方がEV特性評価を構成するため、それらは細胞外小胞の研究のための最小情報2018(MISEV2018)で扱われています。さらに、EV実験の堅牢性を向上させるために、細胞外小胞研究における透明な報告および集中化知識(EV-TRACK)によって監視されています(例えば、制御されていない要因による実験変動を最小限に抑えます)。

方法と対照の報告を奨励する努力にもかかわらず、多くの出版された研究論文は、元のNTA観測を再現するために必要な重要な設定を報告していない。ネガティブコントロールまたは希釈剤のNTA特性評価を報告する論文はほとんどなく、明らかにリン酸緩衝生理食塩水や超純粋な蒸留水などの市販品が粒子を含まないと仮定しています。同様に、陽性対照またはサイズ基準は、粒子サイズを検証するために研究者によって報告されることはめったにありません。ストークス-アインシュタイン方程式には、サンプルの粘度と温度変数が組み込まれており、粒子の変位が決定されます。したがって、サンプルビデオ収集全体を通して安定したレーザーチャンバー温度を報告することは、正確な複製に不可欠な制御手段です。サンプルまたは希釈剤のろ過も日常的に報告されておらず、そうであれば、フィルターの詳細(製造業者、膜材料、孔径)および保管条件はほとんど含まれない。国際細胞外小胞学会(ISEV)の許容可能な実験詳細の最小基準には、EVの特性評価のための十分に文書化されたNTAプロトコルを含めるべきである。次の実験は、NTA分析プロトコルを個々の研究者によって確立し、単一小胞特性評価のためのMISEV2018要件を満たすためのオプションの1つとしてNTA特性評価を使用する出版物の方法に含める必要があるという証拠を提供する。

Introduction

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EVやその他のナノメートルスケールの粒子の正確で再現性のある分析は、研究や業界全体で多くの課題を提示しています。EV研究の再現は、データ収集に関連する必要なパラメータの報告に統一性がないために、部分的には困難であった。これらの欠陥に対処するために、ISEVは、EV研究者のための生化学的、生物物理学的、および機能的基準の最小セットとして業界ガイドラインを提案し、一般にMISEV20141と呼ばれるポジションステートメントとして公開しました。EV研究の加速に伴い、ガイドラインの更新が必要となり、「MISEV2018:ISEVの立場表明」はMISEV2014ガイドライン2を拡張した。MISEV2018の論文には、表、推奨されるプロトコルの概要、および特定のEV関連の特性評価を文書化するための手順が含まれていました。実験の解釈と複製を容易にするためのさらなる措置として、EV-TRACKは、EV生物学および公表された結果に使用される方法論のより透明な報告を可能にするクラウドソーシングナレッジベース(http://evtrack.org)として開発されました3。方法の標準化された報告のためのこれらの勧告にもかかわらず、この分野は公表された結果の複製および確認に関して引き続き苦しんでいる。

この論文は、米国国立衛生研究所と米国国立科学財団の品質評価....

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Protocol

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1. 一般的なプロトコルガイドライン

  1. 顕微鏡はエアテーブルの上、または少なくとも振動のないテーブルで維持してください。無関係な振動(足で床を叩く、テーブルに触れる、ドアの閉まる、実験室の交通量など)を最小限に抑えるようにします。
  2. すべてのビデオ録画でレーザーモジュールの温度を一定温度に設定し、維持します。
    注:ナノ粒子サイズアナライザーがその温度で較正されたため、選択された温度は25°Cでした。したがって、機器のすべてのユーザーが校正された温度を知っていて使用することが重要です。室温は変動する可能性があるため、許容できる設定ではありません。
  3. ネガティブコントロールとも呼ばれるすべての希釈剤(例えば、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)、超純粋な蒸留水[DW])が、測定対象のナノ粒子サンプルと同じカメラレベルおよび検出閾値を使用して、すべてNTA特性評価されていることを確認してください。レーザーモジュールのフラッシングとサンプルの希釈に特性化されたDPBSを使用してください。ネガティブコントロールDPBS中の因子汚染物質は、そのレベルが有意であればサンプル結果に。
  4. 評価前にサンプルを4°Cで保存し、リポソームサンプルを分解するため、凍結しないでください。分析前に、サンプル/標準/希釈剤を室温に30分間温めます。
    注:サンプルの取り扱いは、調査対象の材料に固有のものでした。

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Results

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表1 は、リポソームサンプル(18個の濾過済みおよび18個の未濾過)および代表的なDPBS希釈剤についてのNTAビデオの結果を含む。このホワイトペーパーでは、カメラレベルまたは検出しきい値に関係なく、2つのグループ間の比較が完了しました。濾過されたサンプルは、平均粒子径108.5nm、粒子モード86.2nm、および濃度7.4×108 粒子/mLであった。対照的に、濾過されていないサンプルは、平均粒子径が159.1nm、粒子モードが105.7nm、濃度が7.6×108 粒子/mLであった。フィルタリングされたサンプルおよびフィルタリングされていないサンプルの平均値およびモード値は、カメラレベルまたは検出閾値にかかわらず、統計的に有意であった(p<0.05)。フィルターをかけたサンプルとろ過されていないサンプルの間の濃度の差は、カメラレベルまたは検出閾値に関係なく、有意ではありませんでした(p = 0.86)。

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Discussion

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ナノ粒子11のサイズおよび濃度を推定するために利用可能ないくつかの方法がある。これらには、動的光散乱(DLS)、遠心沈降、および単一粒子レベルの分析 - 電子顕微鏡、NTA、原子間力顕微鏡、および調整可能な抵抗パルスセンシングを含む、集団からサイズ推定値を生成するアンサンブル法が含まれる。これらのうち、DLSおよびNTAは、理想的な媒体中でのブラウン運動に基づく、非破壊的なサイズおよび濃度測定方法として広く使用されている。DLSは光の散乱に依存し、強度は粒子体積の2乗に比例する。したがって、DLSは、大きな粒子、凝集体、または多分散集団の存在に対してNTAよりも敏感である。

NTA は、連続するビデオ フレームで測定された個々の粒子のパス長から拡散係数を計算します。NTAの主な制限は、DLSやその他の測定方法と比較して評価できる粒子濃度の範囲が狭いため、個々の粒子経路長が顕微鏡の回折限界とトラッキングソフトウェアの能力内に収まらなければならないことです。DLSとNTAはブラウン運動に依存しているため、どちらも単分散集団で良好なサイズ一.......

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Disclosures

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いずれの著者も利益相反を負わない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、カンザス州から中西部比較幹細胞生物学研究所(MICSCB)、ジョンソンがん研究センターからMLW、NIH R21AG066488からLKCに支援されました。OLSはMICSCBからGRA支援を受けた。著者らは、このプロジェクトで使用されたリポソームを提供してくれたSantosh Aryal博士と、WeissとChristensonの研究室のメンバーに有益な会話とフィードバックに感謝している。ホン・ヘ博士は技術サポートに感謝しています。MLWはベッティ・ゴレン・ワイスのサポートと助言に感謝する。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
自動ピペッター
遠心チューブ、円錐形、Nunc 15 mLThermo Sci.339650
キムワイプ
レンズクリーナー
レンズペーパー
NanoSight LM-10Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 レーザーモジュールMalvern Panalytical
Nanosight NTA ソフトウェア Ver. 3.2Malvern Panalytical
ペーパータオル
ピペットのヒント、1-200 & マイクロ;L、フィルター付き、滅菌済み、低結合BioExpressP -3243-200X
ピペットチップ、50-1,000 & マイクロ;L、フィルター付き、滅菌済みBioExpressP-3243-1250
生理食塩水、ダルベッコリン酸緩衝液(CaまたはMgなし)Gibco14190-144
標準、ラテックス転写-100 nm(3 mL)MalvernNTA4088
標準、ラテックス転写-50 nm (3mL)マルバーンNTA4087
シリンジフィルター、33 mm、.22 & マイクロ;m, MCE, SterileFisher brand09-720-004
シリンジ, TB, 1mL, スリップチップベクトン・ディキンソン309659
廃液容器

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  2. Thery, C., et al.

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Nanoparticle Tracking AnalysisExtracellular VesiclesNTA ProtocolParticle Size AnalysisSample FiltrationCamera Level AdjustmentDetection ThresholdDynamic Light ScatteringVesicle CharacterizationReproducibility Standards

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