나노입자 추적 분석(NTA)은 세포밖 소포를 특성화하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이 백서에서는 NTA 실험 파라미터 및 제어와 실험실 간 재현성을 위해 MISEV2018 및 EV-TRACK이 제안한 지침을 보완하는 데 필요한 샘플 및 희석제의 균일한 분석 및 특성화 방법을 강조합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
나노 입자 추적 분석의 2018 지침 세포 밖 소포 연구에 대한 최소한의 정보를 충족하기위한 재현성 향상
이 논문에서
요약
초록
나노입자 추적 분석(NTA)은 2006년부터 세포밖 소포(EV) 연구에 사용되는 여러 특성화 방법 중 하나였습니다. 많은 사람들은 NTA 기기와 소프트웨어 패키지를 최소한의 교육만으로 쉽게 활용할 수 있으며 크기 교정이 사내에서 가능하다고 생각합니다. NTA 획득 및 소프트웨어 분석이 모두 EV 특성화를 구성하므로 세포 밖 소포 연구를위한 최소 정보 2018 (MISEV2018)에서 다룹니다. 또한, EV 실험의 견고성을 향상시키기 위해 EV (EV-TRACK)의 투명한보고 및 중앙 집중화 지식에 의해 모니터링되었습니다 (예 : 통제되지 않은 요인으로 인한 실험 변동 최소화).
방법 및 제어에 대한보고를 장려하려는 노력에도 불구하고 많은 출판 된 연구 논문은 원래의 NTA 관찰을 재현하는 데 필요한 중요한 설정을보고하지 못합니다. 음성 대조군 또는 희석제의 NTA 특성화를보고하는 논문은 거의 없으며, 인산염 완충 식염수 또는 초순수 증류수와 같은 상업적으로 이용 가능한 제품이 미립자가 없다고 분명히 가정합니다. 마찬가지로, 긍정적 인 통제 또는 크기 표준은 입자 크기를 확인하기 위해 연구자에 의해보고되는 경우는 거의 없습니다. Stokes-Einstein 방정식은 입자 변위를 결정하기 위해 샘플 점도와 온도 변수를 통합합니다. 따라서 전체 샘플 비디오 수집 동안 안정적인 레이저 챔버 온도를 보고하는 것은 정확한 복제를 위한 필수적인 제어 측정입니다. 샘플 또는 희석제의 여과는 또한 일상적으로 보고되지 않으며, 만약 그렇다면, 필터의 특이성(제조자, 막 물질, 기공 크기) 및 저장 조건은 거의 포함되지 않는다. 국제 세포밖 소포 학회 (ISEV)의 허용 가능한 실험 세부 사항에 대한 최소한의 표준에는 EV의 특성화를위한 잘 문서화 된 NTA 프로토콜이 포함되어야합니다. 다음 실험은 NTA 분석 프로토콜이 개별 연구자에 의해 수립되어야 한다는 증거를 제공하며, 단일 소포 특성화에 대한 MISEV2018 요구 사항을 충족하기 위한 옵션 중 하나로 NTA 특성화를 사용하는 출판물 방법에 포함되어야 한다는 증거를 제공합니다.
서론
EV 및 기타 나노미터 크기의 입자에 대한 정확하고 반복 가능한 분석은 연구 및 산업 전반에 걸쳐 수많은 과제를 제시합니다. EV 연구의 복제는 부분적으로 데이터 수집과 관련된 필요한 매개 변수를보고하는 데 균일 성이 없기 때문에 어려웠습니다. 이러한 결함을 해결하기 위해 ISEV는 EV 연구원을위한 생화학적, 생물 물리학 적 및 기능적 표준의 최소 세트로 산업 지침을 제안하고 일반적으로 MISEV20141이라고하는 입장 성명서로 발표했습니다. EV 연구의 속도가 빨라지면서 업데이트 된 지침이 필요했으며 "MISEV2018 : ISEV의 입장 진술"은 MISEV2014 지침2를 확장했습니다. MISEV2018 논문에는 테이블, 제안된 프로토콜의 개요 및 특정 EV 관련 특성을 문서화하기 위해 따라야 할 단계가 포함되어 있습니다. 실험의 해석 및 복제를 용이하게하기위한 추가 조치로서 EV-TRACK은 EV 생물학 및 발표 된 결과에 사용 된 방법론에 대한보다 투명한보고를 가능하게하는 크라우드 소싱 지식 기반 (http://evtrack.org)으로 개발되었습니다3. 표준화 된 방법보고에 대한 이러한 권장 사항에도 불구하고이 분야는 게시 된 결과를 복제하고 확인하는 것....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 일반 프로토콜 지침
- 현미경을 공기 테이블 위에 유지하거나 진동이 없는 테이블에 최소한 유지하십시오. 외부 진동 (예 : 바닥에서 발 두드리기, 테이블 만지기, 문 닫힘, 실험실 교통)이 최소한으로 유지되도록하십시오.
- 레이저 모듈의 온도를 모든 비디오 녹화에 대해 일정한 온도로 설정하고 유지하십시오.
참고: 선택한 온도는 25°C였는데, 이는 나노입자 크기 분석기가 그 온도에서 교정되었기 때문입니다. 따라서 계측기의 모든 사용자가 보정된 온도를 알고 사용하는 것이 중요합니다. 실내 온도는 다양 할 수 있기 때문에 허용 할 수있는 설정이 아닙니다. - 음성 대조군(예: 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS), 초순수 증류수[DW])이라고도 하는 모든 희석제가 모두 측정되는 나노입자 샘플과 동일한 카메라 수준 및 검출 임계값을 사용하여 NTA로 특성화되었는지 확인하십시오. 레이저 모듈의 플러싱 및 샘플의 희석을 위해 특성화된 DPBS를 사용하십시오. 음성 대조군 DPBS의 인자 오염물질은 그들의 수준이 유의한 경우 샘플 결과로.
- 평가 전에 샘플을 4°C에 보관하고 리포좀 샘플을 분해하므로 절대로 동결시키지 마십시오. 분석 전에 샘플/표준/희석제를 30분 동안 실온으로 가온합니다.
참고....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
표 1 은 리포좀 샘플(18개의 여과 및 18개의 여과되지 않은) 및 대표적인 DPBS 희석제에 대한 NTA 비디오의 결과를 함유한다. 두 그룹에 걸친 비교는 이 백서의 카메라 레벨 또는 감지 임계값에 관계없이 완료되었습니다. 여과된 샘플은 평균 입경이 108.5nm, 입자 모드가 86.2nm, 농도가 7.4 ×10,8 입자/mL였다. 대조적으로, 여과되지 않은 샘플은 평균 입자 직경이 159.1 nm, 입자 모드가 105.7 nm, 농도가 7.6 × 108 입자 / mL였습니다. 카메라 레벨 또는 검출 역치에 관계없이 필터링되고 필터링되지 않은 샘플에 대한 평균 및 모드 값은 통계적으로 유의하였다(p<0.05). 여과된 샘플과 여과되지 않은 샘플 사이의 농도 차이는, 카메라 레벨 또는 검출 역치에 관계없이, 유의하지 않았다(p=0.86).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
나노입자(11)의 크기 및 농도를 추정하기 위해 이용가능한 몇 가지 방법이 있다. 여기에는 동적 광 산란 (DLS), 원심 침강 및 단일 입자 레벨 분석 - 전자 현미경, NTA, 원자력 현미경 및 조정 가능한 저항 펄스 감지를 포함하여 집단으로부터 크기 추정치를 생성하는 앙상블 방법이 포함됩니다. 이 중 DLS와 NTA는 이상적인 매질에서의 브라운 운동을 기반으로 한 비파괴 크기 및 농도 측정 방법으로 널리 사용됩니다. DLS는 빛의 산란에 의존하며 강도는 입자 부피의 제곱에 비례합니다. 따라서, DLS는 큰 입자, 응집체, 또는 다분산 집단의 존재에 대해 NTA보다 더 민감하다.
NTA는 연속적인 비디오 프레임에서 측정된 개별 파티클의 경로 길이로부터 확산 계수를 계산합니다. NTA의 주요 한계는 DLS 및 기타 측정 방법과 비교하여 평가할 수있는 좁은 범위의 입자 농도이므로 개별 입자 경로 길이는 현미경 및 추적 소프트웨어의 기능의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자 중 누구도 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캔자스 주에서 중서부 비교 줄기 세포 생물학 연구소 (MICSCB), 존슨 암 연구 센터 (Johnson Cancer Research Center)에서 MLW 및 NIH R21AG066488에서 LKC로 지원되었습니다. OLS는 MICSCB로부터 GRA 지원을 받았습니다. 저자는이 프로젝트에 사용 된 리포솜을 제공 한 Santosh Aryal 박사와 Weiss 및 Christenson 연구소의 회원들에게 도움이되는 대화와 피드백을 제공합니다. 홍 박사 그는 기술 지원에 감사드립니다. MLW는 Betti Goren Weiss에게 그녀의 지원과 조언에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자동 피펫터 | |||
| 원심분리기 튜브, 원뿔형, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| 렌즈 클리너 | |||
| 렌즈 종이 | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 레이저 모듈 | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA 소프트웨어 Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| 종이 타월 | |||
| 피펫 팁, 1-200 µ L, 여과, 멸균, 낮은 바인딩 BioExpress | P -3243-200X | ||
| 피펫 팁, 50-1,000 &마이크로; L, 여과, 멸균 | BioExpress | P-3243-1250 | |
| 식염수, Dulbecco의 인산염 완충 (Ca 또는 Mg 없음) | Gibco | 14190-144 | |
| 표준, 라텍스 전송- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| 표준, 라텍스 전송- 50 nm (3mL) | Malvern | NTA4087 | |
| 주사기 필터, 33 mm, .22 µ m, MCE, Sterile | Fisher 브랜드 | 09-720-004 | |
| 주사기, TB, 1mL, 슬립 팁 | Becton Dickinson | 309659 | |
| 폐액 용기 |
참고문헌
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
