Использование кристаллической фиалки для улучшения визуального цитопатического эффекта для титрования вируса с использованием анализов TCID50
Summary
Этот протокол показывает точный и объективный подход к визуализации титрования вируса с использованием кристаллического фиолетового, сравнивая его с оптической микроскопией и иммуноцитохимическим окрашиванием.
Abstract
Титрование вируса является ключевым анализом для вирусологических исследований. Обнаружение цитопатического эффекта (CPE) с помощью анализов TCID50 и анализов бляшечно-образующих единиц (PFU) являются двумя основными методами расчета титра запаса вируса и часто основаны на микроскопическом обнаружении или окрашивании клеток для визуализации. В случае анализа TCID50 объективная визуализация обычно основана на иммуноцитохимическом (ICC) окрашивании внутриклеточного вируса для расчета титров в сочетании с визуальным обнаружением CPE с помощью микроскопии. Однако окрашивание ICC является дорогостоящим и трудоемким. В этом исследовании мы сравнили визуальное наблюдение CPE с помощью микроскопии, окрашивания ICC и кристаллического фиолетового окрашивания для определения титров двух CPE-образующих вирусов, вируса гриппа A (IAV) свиного происхождения и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Мы показываем, что как кристаллическое фиолетовое, так и ICC окрашивание являются более точными, чем визуальное обнаружение CPE, обеспечивая почти одинаковые уровни точности как на IAV, так и на PRRSV. По этой причине здесь мы представляем кристаллическое фиолетовое окрашивание как более быстрый и доступный способ определения титрования вируса на анализе TCID50 для CPE-образующих вирусов, титрованных в клеточных линиях.
Introduction
Титрование вируса с помощью анализа TCID50 является широко используемым методом в исследованиях инфекционных заболеваний1. Хотя вариации математики, лежащей в основе этого метода, были предложены с течением времени1,2,3,4, применяемые в настоящее время методы обнаружения инфекции основаны на визуальном подтверждении через наличие цитопатического эффекта (CPE) с использованием микроскопии5. Чтобы подтвердить визуализацию CPE более объективно на анализах TCID50, иммуноцитохимическое (ICC) внутриклеточное окрашивание, нацеленное на белки вируса, является одним из наиболее часто используемых методов6, поскольку различные вирусы могут продуцировать различные формы CPE. В нашем случае клеточные морфологические изменения аналогичны при заражении как вирусом гриппа А (IAV), так и вирусом репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), где инфицированные клетки округляются и отделяются от пластины. В случае PRRSV он вызывает CPE, известный как «полное разрушение», когда все клетки в конечном итоге отделяются от колодца. IAV, с другой стороны, может представлять как полное разрушение, так и дополнительный CPE, известный как «субтотальное разрушение», когда небольшое количество клеток не отделяется после заражения7. Однако этот метод занимает много времени и требует использования относительно дорогостоящих реагентов. Важно отметить, что ICC не маркирует CPE, а скорее количество клеток, успешно инфицированных вирусом. Это означает, что клетки, которые были успешно инфицированы к концу инкубации, будут рассматриваться как положительные, даже если инфекция еще не вызвала CPE, и, таким образом, ожидается более высокий процент положительных клеток ICC по сравнению с CPE. По этой причине в этом исследовании мы описываем дополнительный метод визуального обнаружения CPE в анализе TCID50 на основе кристаллического фиолетового, химического вещества с положительным зарядом, которое прикрепляется к клеточным мембранам и используется для окрашивания адгезивных клеток. Кристаллическая фиалка часто используется в вирусологических исследованиях для измерения бляшечных единиц, среди прочих8.
В этом исследовании мы сравниваем чувствительность обнаружения CPE в неокрашенной микроскопии с окрашиванием кристаллического фиолетового цвета и иммуноцитохимическим окрашиванием на основе распознавания вирусного белка, которое, как известно, является более объективным из-за его высокой чувствительности. Это исследование показывает, что как кристаллическое фиолетовое, так и иммуноцитохимическое окрашивание являются более точными, чем обнаружение CPE на основе визуальной микроскопии, и могут быть использованы для объективной идентификации инфицированных скважин при титровании TCID50. Учитывая их способность достигать почти одинакового уровня точности на цитопатических вирусах, протестированных в клеточных линиях, кристаллический фиолетовый представлен как более быстрый и доступный способ определения титрования вируса на анализе TCID50. Предлагаемый способ с использованием кристаллического фиолетового окрашивания занимает в общей сложности 40 мин для выполнения, с 15 мин для инкубации параформальдегида (PFA), 5 мин для инкубации кристаллической фиалки и максимум 15 мин для подготовки материала, буферной промывки и сушки. Протокол иммуноцитохимии, применяемый для сравнения, занимает в среднем 4 ч 30 мин и был выполнен так, как описано ранее9,10. Предложенный метод направлен на то, чтобы помочь визуализировать завершенное титрование вируса. Время заражения и инкубации может быть выполнено с различной компоновкой в зависимости от вируса. Здесь мы протестировали два РНК-вируса с цитопатическим действием на клеточные линии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Титрование вирусов обычно используется в вирусологических исследованиях, при этом наиболее часто используются определения PFU и анализы TCID501,2,3,4. Оба метода основаны на обнаружении CPE в инфицированных клетках, и хотя ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Фрэнка Шолле за его полезные комментарии в рукописи, Хлою Мариант за ее помощь с микроскопическими изображениями и Терезу М. Тидже за ее полезную английскую редакцию.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg’s Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss’s formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C. Cytopathic effects of viruses protocols. American Society of Microbiology. , (2007).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. . Influenza Virus. , 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
