Brug af Crystal Violet til at forbedre visuel cytoppatisk effektbaseret læsning til viral titrering ved hjælp af TCID50 Assays
Summary
Denne protokol viser en præcis og objektiv tilgang til at visualisere virale titrationer ved hjælp af krystal violet, ved at sammenligne det med optisk mikroskopi og immunocytokemisk farvning.
Abstract
Viral titrering er en vigtig analyse for virologi forskning. Påvisning af cytopatisk effekt (CPE) via TCID50 assays og plaque-danner enheder (PFU) assays er de to vigtigste metoder til at beregne titer af en virus lager og er ofte baseret på mikroskopi afsløring eller celle farvning til visualisering. I tilfælde af TCID50-analyse er objektiv visualisering almindeligvis baseret på immuncytokemisk (ICC) farvning af intracellulær virus til beregning af titere kombineret med visuel CPE-påvisning via mikroskopi. Men, ICC farvning er dyrt og tidskrævende. I denne undersøgelse sammenlignede vi visuel CPE-observation via mikroskopi, ICC-farvning og krystal violet farvning for at bestemme titerne af to CPE-dannende vira, Influenza A-virus (IAV) af svineoprindelse og porcine reproduktive og respiratoriske syndromvirus (PRRSV). Vi viser, at både krystal violet og ICC farvning er mere præcise end visuel CPE detektion, der præsenterer næsten identiske niveauer af præcision på både IAV og PRRSV. Af denne grund præsenterer vi her krystal violet farvning som en hurtigere og mere overkommelig måde at bestemme virale titreringer på en TCID50-analyse for CPE-dannende vira titreret i cellelinjer.
Introduction
Viral titrering via TCID50 assay er en almindeligt anvendt teknik i infektionssygdomme forskning1. Selv om variationer i matematikken bag denne metode er blevet foreslået over tid1,2,3,4, de aktuelt anvendte metoder til infektion afsløring stole på visuel bekræftelse gennem tilstedeværelsen af cytopatisk effekt (CPE) ved hjælp af mikroskopi5. For at bekræfte CPE visualisering mere objektivt på TCID50 assays, immunocytokemiske (ICC) intracellulære farvning rettet mod proteiner af virus er en af de mest almindeligt anvendte metoder6 som forskellige vira kan producere forskellige former for CPE. I vores tilfælde er cellemorfologiske ændringer ens, når de er inficeret med både Influenza A-virus (IAV) og Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), hvor inficerede celler runde op og løsner sig fra pladen. I tilfælde af PRRSV forårsager det en CPE kendt som “total ødelæggelse”, hvor alle celler ender med at løsne sig fra brønden. IAV på den anden side, kan præsentere både total ødelæggelse og en ekstra CPE kendt som “subtotal ødelæggelse”, hvor et lille antal celler ikke løsne efter infektion7. Denne teknik er dog tidskrævende at udføre og kræver brug af relativt dyre reagenser. Det er vigtigt at bemærke, at ICC ikke mærker CPE, men snarere antallet af celler, der med succes er inficeret med virus. Dette indebærer, at de celler, der blev med succes inficeret ved udgangen af inkubationen vil blive betragtet som positive, selv om infektionen ikke har forårsaget CPE endnu, og dermed en højere procentdel af ICC positive celler i forhold til CPE forventes. Af denne grund beskriver vi i denne undersøgelse en komplementær metode til visuel påvisning af CPE i en TCID50-analyse baseret på krystal violet, et kemikalie med en positiv ladning, der tillægger cellemembraner og bruges til at plette klæbende celler. Krystal violet er ofte udnyttet i virologi forskning til at måle plaque-dannende enheder, blandt andre8.
I denne undersøgelse sammenligner vi følsomheden af ikke-farvet mikroskopi CPE-detektion med krystal violet farvning og immunocytokemisk farvning baseret på viral proteingenkendelse, som er kendt for at være mere objektiv på grund af dens høje følsomhed. Denne undersøgelse viser, at både krystal violet og immunocytokemisk farvning er mere præcise end visuel mikroskopi-baseret CPE-påvisning og kan bruges til objektivt at identificere inficerede brønde i en TCID50 titrering. I betragtning af deres evne til at nå næsten identisk niveau af nøjagtighed på cytoppatiske vira testet i cellelinjer, krystal violet præsenteres som en hurtigere og mere overkommelig måde at bestemme virale titreringer på en TCID50 assay. Den foreslåede metode ved hjælp af krystal violet farvning tager en samlet tid på 40 min til at udføre, med 15 min for paraformaldehyd (PFA) inkubation, 5 min for krystal violet inkubation og højst 15 min for materiale forberedelse, buffer vasker, og tørring. Immuncytokemiprotokollen, der anvendes til sammenligning, tager en gennemsnitlig tid på 4 timer og blev udført som tidligere beskrevet9,10. Den foreslåede metode har til formål at hjælpe med at visualisere en afsluttet viral titrering. Infektions- og inkubationstider kan udføres med forskellige layout afhængigt af virussen. Her testede vi to RNA-vira med cytoppatisk effekt på cellelinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viral titreringer rutinemæssigt anvendes i virologi forskning, med PFU detektion og TCID50 assays mest almindeligt anvendte1,2,3,4. Begge metoder er afhængige af påvisning af CPE i inficerede celler, og selvom de kan vurderes visuelt via mikroskopi, anvendes en farvning normalt for at opnå et mere objektivt resultat eller endda reducere inkubationstiderne. I tilfælde af TCID50, en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere vil gerne anerkende Dr. Frank Scholle for hans nyttige kommentarer i manuskriptet, Chloe Mariant for hendes hjælp med mikroskopi billeder og Teresa M. Tiedge for hendes nyttige engelske revision.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg’s Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss’s formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C. Cytopathic effects of viruses protocols. American Society of Microbiology. , (2007).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. . Influenza Virus. , 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
