本文描述了一种用于测量肥胖小鼠产热性脂肪细胞基础代谢率和氧化能力的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
测量能量消耗对于理解代谢变化如何导致肥胖至关重要。通过使用代谢笼测量小鼠的全身体耗氧量、CO2 产生量以及身体活动，可以确定其基础能量消耗。产热性的棕色/米色脂肪细胞（BA）在啮齿类动物的能量消耗中起着重要作用，尤其在环境温度较低时更为显著。本文提供了两项详细实验方案，用于测量肥胖小鼠的基础能量消耗以及其棕色/米色脂肪细胞的总能量消耗能力：第一项方案介绍了如何建立基于协方差分析（ANCOVA）的基础能量消耗测定方法，该统计方法是必要的，因为能量消耗与体重存在协变关系；第二项方案描述了如何在小鼠体内（in vivo）测定棕色/米色脂肪细胞的能量消耗能力，该过程包括麻醉（以减少身体活动引起的能量消耗）以及注射β3-肾上腺素能受体激动剂CL-316,243，以激活棕色/米色脂肪细胞中的能量消耗。本文对这两项方案及其局限性进行了充分详尽的描述，以确保研究者能够成功完成首次实验。
引言
新陈代谢可被定义为细胞用于生长和执行其功能的营养物质摄取、储存、转化和分解等生化反应的整合过程。代谢反应将营养物质中所含的能量转化为细胞可利用的形式，以合成新的分子并完成各种功能活动。这些生化反应在将能量转化为维持生命所需的可用形式时本质上是低效的1。这种低效性导致能量以热的形式耗散，而这种产热可用于量化生物体的标准代谢率（SMR）1。标准条件的经典定义是指清醒但处于静息状态的成年个体，在未进食和消化食物、处于热中性环境且无任何应激状态下所产生的热量1。小鼠的基础代谢率（BMR）或基础能量消耗通常被称为SMR，但指的是在轻度热应激条件下（环境温度为21–22 °C）进食和消化食物的个体的代谢率1。由于直接测量产热存在诸多挑战和困难，间接测热法——即通过测量耗氧量来计算产热量——已成为测定BMR最常用的方法。之所以能够通过耗氧量来计算BMR，是因为线粒体通过氧化营养物质合成ATP的过程占生物体总耗氧量的72%，另有8%的耗氧也发生在线粒体中，但不生成ATP（解偶联呼吸）1。其余约20%的耗氧主要归因于其他亚细胞部位的营养物质氧化（如过氧化物酶体中的脂肪酸氧化）、合成代谢过程以及活性氧的生成1。因此，Lusk于1907年基于实测数据建立了一个广泛使用的....
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方案
所有实验均经加州大学洛杉矶分校（UCLA）机构动物护理和使用委员会批准。小鼠在代谢笼中饲养，环境温度受控（约21-22或30 °C），光照周期为12小时明/12小时暗，饮食和饮水均自由供应（ad libitum）。本研究采用8周龄雌性小鼠，分别喂食高脂饮食或普通饲料8周。
1. 基础代谢率（BMR）的测定
- 使用精度为0.1 g的电子天平测量小鼠的总体重。
注意：此步骤必须在将小鼠放入代谢笼之前，并在小鼠适应代谢笼环境2-3天后进行。 - 使用合适的身体成分分析系统（参见 材料表).
注意：这些测量用于确定能量消耗，需与全身重量测量（步骤 1.1）同时进行。 - 设置代谢笼并开始适应期。
注意：代谢笼系统包含一个封闭装置，可让用户控制12个笼子的饲养温度和光照图1A，B每个笼子均配备一个水瓶、一个饲料盒和一个网格图1C）。网格将小鼠与笼底隔开，以便收集粪便。将笼子安装到每个预设位置后，盖上密封笼子的盖子，盖子上包含水瓶插槽、空气采样管路、气流系统以及活动量传感器。图1D).-
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结果
图4展示了使用CLAMS系统代谢笼测得的VO2、VCO2、产热量/能量消耗（EE）、呼吸交换比（RER）以及X、Y、Z方向的活动量数值。CLAMS系统提供的VO2和VCO2为每分钟气体体积（mL/min），可在开始测量前将体重或瘦体重数值输入CLAMS软件，从而自动按体重或瘦体重进行标准化。然而，若不同组小鼠之间存在体重差异，则不应输入体重数值，因为此时需要进行协方差分析（ANCOVA），而Oxymax软件无法完成此类计算。能量消耗（产热）采用Lusk方程计算，单位为kcal/h。小鼠为夜行性动物，在夜间/黑暗期消耗更多能量，因此能量消耗的计算需根据光照周期分别进行。如预期所示，在黑暗期，小鼠的O2消耗量、CO2产生量以及能量消耗均更高，如图4C所示。处于常规饮食状态且在进食状态（食物摄入主要发生在黑暗期）的小鼠，其RER值接近1（图4D
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讨论
间接热量测定法已使用多年，用于评估全身能量消耗4。本文所述方案提供了一种简单的方法，利用代谢笼在活体（in vivo）条件下测量基础代谢率并确定棕色脂肪组织（BA）的产热能力。
本文所述的间接测热法证实，将能量消耗值除以体重值可能会产生误导。例如，这种方法可能得出结论：所有肥胖小鼠模型的能量消耗系统性地较低。然而，在某些肥胖小鼠模型中，总能量消耗可能更高，例如因摄食增加导致肥胖的情况。因此，若将能量消耗除以脂肪质量，总会导致对肥胖小鼠（其本身无能量消耗原发性缺陷）肥胖成因过程的误判。此外，当瘦体重发生变化时，将其作为分母同样不恰当，因为瘦体重与能量消耗共变，且能量消耗的下降幅度可能远大于瘦体重的任何变化。这意味着，仅当被测组之间未观察到体重或体成分（即瘦体重和脂肪质量）变化时，才可将能量消耗除以体重或瘦体重。因此，最稳妥的方法是进行协方差分析（ANCOVA）。该问题已在多篇优秀文章中广泛讨论，所有这些文章均得出结论：在比较总体重或瘦体重不同的小鼠组间能量消耗时，协方差分析（ANCOVA）至关重要
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披露
作者声明本实验方案论文无利益冲突。M.L. 是 Enspire Bio LLC 的联合创始人及顾问。
致谢
ML 由加州大学洛杉矶分校（UCLA）医学院资助，以及来自 P30 DK 41301（UCLA：DDRC NIH）和 P30 DK063491（UCSD-UCLA DERC）的试点项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CLAMS-Oxymax 系统 | Columbus Instruments | CLAMS-中央进料器-ENC | 包含环境控制箱和氧化锆氧气传感器 |
| 配备 Oxymax 软件的台式电脑 | HP/Columbus | N/A | 电脑需单独购买 |
| 干燥剂瓶（含氯化钴指示剂的硫酸钙） | Fisher Scientific | 23-116681 | 用于干燥进入氧气传感器的气体，湿气可能损坏传感器 |
| 用于体成分分析的核磁共振仪（NMR） | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | 用于活体小鼠的瘦体质量和脂肪质量测定，是进行协方差分析（ANCOVA）所必需的 |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | 皮下注射给小鼠以激活产热作用 |
| 高脂饮食 | Research Diets | D12266B | 在测量前及测量期间提供给小鼠 |
| 戊巴比妥钠/Nembutal | DLAM 药房 | N/A | 用于小鼠麻醉 |
| 一级标准气体（气瓶及减压阀） | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 含20.50%氧气、0.50% CO2，以氮气为平衡气，用于仪器校准 |
参考文献
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue p....
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重印与许可
