यह प्रोटोकॉल सीटू अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता में अध्ययन करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि को दर्शाता है। यह वर्णन करता है कि पूर्व विवो शारीरिक रूप से प्रासंगिक तीव्र मस्तिष्क स्लाइस कैसे तैयार किया जाए और एक उपयोगकर्ता के अनुकूल विश्लेषण पाइपलाइन प्रदान करता है।
न्यूरोनल विकास के दौरान, अक्षतंतु अपने अंतिम गंतव्यों तक पहुंचने और सिनैप्टिक कनेक्शन स्थापित करने के लिए कॉर्टिकल वातावरण को नेविगेट करते हैं। विकास शंकु – अक्षतंतुओं के विकास के दूरस्थ सुझावों पर स्थित संवेदी संरचनाएं – इस प्रक्रिया को निष्पादित करती हैं। विकास शंकु की संरचना और गतिशीलता का अध्ययन करना क्षैतिज विकास और आसपास के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के साथ बातचीत को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जो इसे तंत्रिका सर्किट बनाने में सक्षम बनाता है। मौलिक अनुसंधान और पूर्व-नैदानिक संदर्भों में चोट के बाद अक्षतंतुओं को तंत्रिका सर्किट में फिर से एकीकृत करने के तरीकों को तैयार करते समय यह आवश्यक है। इस प्रकार अब तक, विकास शंकु गतिशीलता की सामान्य समझ मुख्य रूप से दो आयामों (2 डी) में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के अध्ययन पर स्थापित की जाती है। यद्यपि निस्संदेह विकास शंकु संरचनात्मक गतिशीलता और उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया के वर्तमान ज्ञान के लिए मौलिक है, 2 डी अध्ययन बरकरार सीएनएस ऊतक में न्यूरोनल विकास शंकु द्वारा सामना किए गए शारीरिक तीन आयामी (3 डी) वातावरण को गलत तरीके से प्रस्तुत करते हैं। हाल ही में, कोलेजन जैल को इनमें से कुछ सीमाओं को दूर करने के लिए नियोजित किया गया था, जिससे 3 डी में न्यूरोनल विकास की जांच को सक्षम किया जा सके। हालांकि, सिंथेटिक 2 डी और 3 डी दोनों वातावरणों में सीएनएस ऊतक के भीतर सिग्नलिंग संकेतों की कमी होती है, जो अक्षतंतुओं के विकास के विस्तार और पथ खोज को निर्देशित करते हैं। यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोटाइपिक मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके अक्षतंतुओं और विकास शंकुओं का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, जहां विकासशील अक्षतंतु शारीरिक रूप से प्रासंगिक भौतिक और रासायनिक संकेतों का सामना करते हैं। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों को विरल रूप से वितरित करने के लिए गर्भाशय और पूर्व गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में ठीक-ठाक संयोजन करके, यह प्रोटोकॉल अक्षतंतु और सीटू में विकास शंकु गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक पद्धतिगत पाइपलाइन प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, दीर्घकालिक और लाइव-सेल इमेजिंग डेटा के विश्लेषण का एक विस्तृत टूलकिट विवरण शामिल है।
न्यूरॉन्स अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं जो तंत्रिका तंत्र में बुनियादी कम्प्यूटेशनल इकाई का प्रतिनिधित्व करती हैं। वे ऐसी जानकारी प्राप्त करते हैं और उत्सर्जित करते हैं जो इनपुट और आउटपुट साइटों के कंपार्टमेंटेशन पर निर्भर करती है: डेंड्राइट्स और अक्षतंतु, क्रमशः1। विकास के दौरान, अक्षतंतु अपने गंतव्य तक पहुंचने के लिए एक अविश्वसनीय जटिल वातावरण को नेविगेट करते हुए विस्तारित होते हैं। अक्षतंतु नेविगेशन विकास शंकु द्वारा निर्देशित होता है, जो विकासशील अक्षतंतु की नोक पर स्थित एक संवेदी संरचना है। विकास शंकु पर्यावरणीय संकेतों का पता लगाने और उन्हें अपने साइटोस्केलेटन 2,3 के गतिशील स्थानिक पुनर्गठन में अनुवाद करने के लिए जिम्मेदार है। परिणामी मोर्फो-यांत्रिक प्रतिक्रियाएं विकास शंकु को ट्रिगरिंग क्यू से विस्तारित या पीछे हटने का निर्देश देती हैं, जिससे विशिष्ट अक्षतंतु युद्धाभ्यास होता है।
अक्षतंतु विस्तार और विकास शंकु गतिशीलता की वर्तमान समझ दो आयामी (2 डी) सब्सट्रेट्स 2,4,5,6,7 पर अक्षतंतु विकास का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों से उपजी है। इन अग्रणी अध्ययनों ने विकास शंकु और विकास सब्सट्रेट के बीच परिष्कृत इंटरप्ले की पहचान की और सब्सट्रेट विशेषताओं जैसे कि चिपकने और कठोरता 8,9 पर निर्भर हड़ताली अंतरका खुलासा किया। इन अंतर्दृष्टि के नेतृत्व में, बाह्य कोशिकीय पर्यावरणीय संकेतों को अक्षतंतु विकास को निर्देशित करने के लिए परिकल्पना की गई थी, जिसमें विकास शंकु साइटोस्केलेटन ने इस विकासको 2,10,11,12 निष्पादित किया था। विशेष रूप से, न्यूरॉन्स गैर-चिपकने वाले सब्सट्रेट (जैसे, पॉली-लाइसिन, पॉली-ऑर्निथिन) में अक्षतंतुओं का विस्तार कर सकते हैं। इसके अलावा, सब्सट्रेट कठोरता सेल चिपकने वाले परिसरों से स्वतंत्र अक्षतंतु विकास दर को प्रभावित कर सकती है8। इसलिए, अकेले 2 डी सब्सट्रेट्स में विकास शंकु गतिशीलता का अध्ययन करना उन बलों के संतुलन को सटीक रूप से मॉडल नहीं कर सकता है जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक तीन-आयामी (3 डी) वातावरण के साथ अक्षीय विकास शंकु की बातचीत से उत्पन्न होते हैं, जैसे कि विवो में पाए जाने वाले।
2 डी assays की सीमाओं को दूर करने के लिए, अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता 3 डी matrices 8,9 में अध्ययन किया गया है। ये matrices अधिक शारीरिक संदर्भ अभी तक अक्षतंतु विकास के सेल-आंतरिक तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। यह विभिन्न स्थितियों और औषधीयउपचारों की एक किस्म में एकल-सेल फैशन में विकास शंकु परीक्षा को सक्षम बनाता है। इस तरह के 3 डी वातावरण में, अक्षतंतुओं ने अलग-अलग साइटोस्केलेटल गतिशीलता प्रदर्शित की और 2 डी सुसंस्कृत न्यूरॉन्स9 में देखे गए लोगों की तुलना में तेजी से बढ़ी। इन सुरुचिपूर्ण अध्ययनों ने विकास शंकु साइटोस्केलेटन के पुनर्गठन पर एक अतिरिक्त आयाम के प्रभाव का प्रदर्शन किया और परिणामस्वरूप, इसके व्यवहार पर।
देशी-जैसे न्यूरोनल विकास और अक्षतंतु विकास का समर्थन करने में 2 डी सतहों पर 3 डी मैट्रिक्स द्वारा प्रस्तुत स्पष्ट लाभों के बावजूद, वे एक सरलीकृत सिंथेटिक पाड़ बने हुए हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ऊतक में देखी गई गतिशीलता की जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। यहां, पूर्व गर्भाशय और गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में रिपोर्टर प्लास्मिड के वितरण को मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस संस्कृति के साथ जोड़ा गया था और एक शारीरिक संदर्भ के भीतर विकास शंकु गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए सीटू लाइव सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में। यह पद्धति अक्षतंतुओं के विकास के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है, जबकि विवो वातावरण में 3-आयामीता और इसकी भौतिक-रासायनिक संरचना की जटिलता का अनुभव करती है। अंत में, आमतौर पर लाइसेंस प्राप्त और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता को मापने के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है।
विकास शंकु एक साथ अक्षतंतु विस्तार और मार्गदर्शन का समन्वय करने के लिए अपने आसपास के वातावरण को कैसे समझते हैं और प्रतिक्रिया करते हैं, यह अभी भी बहस का विषय है 3,18। 2 डी सब्सट्रेट्स में अग्रणी अध्ययनों ने मौलिक आणविक तंत्र में एक झलक प्रदान की जो अक्षतंतु गठन, आउटग्रोथ और नेविगेशन 2,10,11,12,19 के दौरान विकास शंकु गतिशीलता को चलाने वाली ताकतों को उत्पन्न करती है। हाल ही में, 3 डी आव्यूहों में अध्ययन से पता चला है कि विकास शंकु के व्यवहार में तीसरे आयाम का कितना प्रभाव पड़ता है और परिणामस्वरूप अक्षतंतु विकास 8,9 में होता है। फिर भी, विवो में विकास शंकु गतिशीलता को निर्देश देने वाले जटिल तंत्रों की पूरी तरह से जांच की जानी बाकी है।
IUE या EUE दिमाग से organotypic स्लाइस संस्कृतियों की तैयारी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और अच्छी तरह से प्रलेखित है। यह एक सुनहरा मानक बन गया है जो वैज्ञानिकों को जीवित मस्तिष्क ऊतक20,21 में न्यूरॉन्स के विकास और व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति देता है। दरअसल, इस तकनीक का सफलतापूर्वक विभिन्न उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों के साथ संयोजन में उपयोग किया गया है ताकि सीटू में विशिष्ट आणविक प्रक्रियाओं और रूपात्मक घटनाओं की कल्पना की जा सके। इस तरह के अध्ययनों में शामिल हैं, लेकिन अक्षतंतु गठन और विस्तार19,22, कॉर्टिकल न्यूरोनल माइग्रेशन 19,22,23,24, सेंट्रोसोम गतिशीलता25,26, सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता 27, साथ ही साथ पूर्व-और पोस्टसिनेप्टिक डिब्बों की कार्यात्मक गतिशीलता28,29 तक सीमित नहीं हैं।
यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक न्यूरोबायोलॉजी में एक अंतर को संबोधित करता है, जो सीटू में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के विकास की विकास शंकु गतिशीलता को विज़ुअलाइज़ करता है, पूर्व विवो तीव्र मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों में, और प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपकरण।
इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने के लिए तीव्र मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग किया गया था क्योंकि वे (1) कुछ अभ्यास के साथ, उत्पन्न करना आसान है; (2) एक अर्ध-पूरी तरह से शारीरिक वातावरण में एम्बेडेड विकास शंकु का अध्ययन करने के लिए एक सुलभ प्रणाली प्रस्तुत करें, फिर भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव-सेल इमेजिंग की अनुमति देने के लिए पर्याप्त पारदर्शी; (3) ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के असंख्य के साथ इसके उपयोग के लिए विस्तारित किया जा सकता है; (4) या तो IUE या EUE के साथ संयुक्त, फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों और साइटोस्केलेटन जांच के साथ-साथ फ़ंक्शन शासनों के नुकसान / लाभ के तहत विवो में विकास शंकु और अक्षतंतुओं के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए आणविक उपकरण प्रदान करने के लिए लगभग असीमित क्षमता प्रदान करते हैं।
इस पद्धति को EUE और IUE दोनों के संदर्भ में वर्णित किया गया था। हालांकि अभी भी एक अत्यधिक विश्वसनीय विधि है, ईयूई के परिणामस्वरूप मस्तिष्क स्लाइस की एक बढ़ी हुई घटना एक वितरण विधि (चित्रा 4 सी) के रूप में आईयूई के साथ प्राप्त लोगों की तुलना में एक अव्यवस्थित आरजी नेटवर्क दिखा रही है। आरजी सरणी में गड़बड़ी न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षतंतु बढ़ाव30,31 के पैटर्न को दृढ़ता से प्रभावित करती है। ये प्रमुख पैरामीटर हैं जो भविष्यवाणी करते हैं कि किसी दिए गए समय में विश्लेषण के लिए अक्षतंतु कहां खोजने हैं और वे किस प्रकार के वातावरण को नेविगेट कर रहे हैं। एक महत्वपूर्ण रूप से बाधित आरजी नेटवर्क के साथ मस्तिष्क स्लाइस में आमतौर पर बिगड़ा हुआ कॉर्टिकल न्यूरॉन स्तरीकरण होता है। यह, बदले में, अराजक प्रक्षेपवक्र के साथ अक्षतंतु का उत्पादन करता है। इसलिए, यह दृढ़ता से RG नेटवर्क की संरचनात्मक अखंडता के लिए नियंत्रण करने के लिए अनुशंसित है। दिलचस्प बात यह है कि खराब संरचनात्मक अखंडता भ्रूण मस्तिष्क की बढ़ती उम्र के साथ संबंधित है। दरअसल, छोटे E12.5-E13.5 भ्रूण में इस तरह के प्रभाव आमतौर पर19 नहीं देखे गए थे।
वर्तमान प्रोटोकॉल पूरी तरह से और सीधा है। फिर भी, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जहां इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए विशेष देखभाल और ध्यान दिया जाना चाहिए। इन्हें प्रोटोकॉल में स्पष्ट रूप से नोट किया गया है और इसमें शामिल हैं (1) विरल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन में उपयोग किए जाने वाले डीएनए की मात्रा को ट्यूनिंग करना; (2) मस्तिष्क के निष्कर्षण के दौरान क्षति से बचना; (3) मस्तिष्क आवरण के दौरान agarose के तापमान को नियंत्रित; (4) किसी दिए गए उम्र के दिमाग के लिए एगारोज़ के आदर्श प्रतिशत का समस्या निवारण; और (5) fluorophores का चयन, जिसका अनुभव इस प्रकार है। प्रोटोकॉल अनुकूलन के दौरान, सीटू इमेजिंग में लाइव-सेल में कई फ्लोरोफोर के प्रदर्शन का परीक्षण किया गया था। LifeAct की तैयारी के लिए मोनोमेरिक GFP वेरिएंट EGFP और नियॉनग्रीन- और लिन-टैग किए गए प्लास्मिड को इस प्रोटोकॉल (चित्रा 5A, B) के लिए चुना गया था। इसके अतिरिक्त, RFP संस्करण mScarlet का परीक्षण किया गया था और इस सेट-अप (डेटा नहीं दिखाया गया) के लिए अत्यधिक उपयुक्त पाया गया था। Multimeric tRFP (dimer) और ZsGreen (tetramer) (चित्रा 5C और पूरक वीडियो 1, दाएं) का भी परीक्षण किया गया था। इन तेजी से तह सुपर उज्ज्वल fluorophores की सिफारिश की जाती है जब विधि को डीएनए वितरण के बाद तेजी से फ्लोरोसेंट सिग्नल पीढ़ी की आवश्यकता होती है।
स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग करने में एक आम अभ्यास नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्थितियों का परीक्षण करने के लिए विभिन्न दिमागों से स्लाइस का उपयोग करना है। यह अवांछित परिवर्तनशीलता के एक अंतर्निहित स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, एक अभिव्यक्ति प्रणाली जो पहचान के लिए पड़ोसी न्यूरॉन्स और पत्रकारों की अभिव्यक्ति के स्वतंत्र संशोधन को सक्षम बनाती है, का उपयोग किया गया था। ध्यान दें कि इस प्रदर्शन (चित्रा 5 सी) में, न्यूरॉन्स के बीच कोई अंतर नहीं था जो फ्लोरोफोर्स में से किसी को भी व्यक्त करता है। हालांकि, एक उदाहरण के रूप में, इस तरह के एक प्लास्मिड मिश्रण को एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन के साथ जोड़ा जाता है जो एक क्रे-संवेदनशील जीन को आश्रय देता है, टीआरएफपी (ड्रे-संवेदनशील) न्यूरॉन्स के साथ लेबल करेगा जो जंगली प्रकार के रूप में बने रहे। इसके विपरीत, ZsGreen (भी Cre-sensitive) recombined न्यूरॉन्स लेबल करेगा। इसलिए, दो अलग-अलग जीनोटाइप के विकास शंकु, और संभवतः फेनोटाइप्स, एक ही मस्तिष्क स्लाइस में एक साथ-साथ अध्ययन किया जा सकता है।
विश्लेषण के लिए अक्षतंतुओं और विकास शंकुओं का स्थानीयकरण एक महत्वपूर्ण विचार है। कॉर्टिकल न्यूरॉन्स ध्रुवीकृत होते हैं जबकि रेडियल रूप से वेंट्रिकुलर ज़ोन (वीजेड) से कॉर्टिकल प्लेट (सीपी) की ओर पलायन करते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, न्यूरॉन्स एक प्रमुख प्रक्रिया (एक भविष्य के डेंड्राइट) और एक अनुगामी प्रक्रिया बनाते हैं जो अक्षतंतु बन जाएगा, अंततः मध्यवर्ती क्षेत्र (आईजेड) में अग्रणी अक्षतंतुओं में शामिल हो जाएगा, अक्षतंतु ट्रैक्ट32 की स्थापना करता है। इसलिए, अक्षीय विकास शंकु को पकड़ने के लिए, इमेजिंग आईजेड में चेताक्षीय फाइबर पर किया गया था, जिसमें सीपी से बाहर निकलने वाले अक्षतंतु और पहले से ही अक्षीय बंडलों से जुड़े शुरुआती उत्पन्न अक्षतंतु शामिल थे; या अंततः, फाइबर में जो आईजेड को अनुप्रस्थ करते हैं और इसके नीचे विस्तारित होते हैं (चित्रा 7)।
यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस के भीतर न्यूरॉन्स के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को निष्पादित करना संभव बनाता है। ऐतिहासिक रूप से, मोटे नमूनों की इमेजिंग करते समय प्रकाश प्रकीर्णन एक महत्वपूर्ण समस्या का सामना करना पड़ा। पिछले दो दशकों में, ऑप्टिकल प्रौद्योगिकियों में व्यापक प्रगति ने मोटे नमूनों की इमेजिंग को संभव बना दिया। यहां, एक लंबी काम करने वाली दूरी के उद्देश्य का उपयोग छोटी संरचनाओं को बेहतर ढंग से देखने के लिए किया गया था, जैसे कि विकास शंकु। अपरिहार्य रूप से, यह प्रोटोकॉल प्रतिगामी एक्टिन प्रवाह या सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता जैसी अधिक विस्तृत घटनाओं को कैप्चर नहीं करता है। लंबी दूरी का उद्देश्य, जिसके लिए कम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) की आवश्यकता होती है, मोटी स्लाइस से जानकारी को संरक्षित करता है। हालांकि, कम काम करने की दूरी के उद्देश्यों के साथ उपयोग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना भी संभव था। इसके लिए संरचनात्मक अखंडता को संरक्षित करने के लिए ग्लास-बॉटम वाले पकवान में स्लाइस के चिकनी हस्तांतरण की आवश्यकता थी। हालांकि, इस विधि का उपयोग करने के परिणामस्वरूप गैस विनिमय के नुकसान के कारण कम उत्तरजीविता-~ 15 एच-(डेटा नहीं दिखाया गया है)। 2 डी संस्कृतियों के विपरीत, 3 डी में विकास शंकु एक बड़ी मात्रा पर कब्जा कर लेते हैं और जेड-अक्ष में आंदोलन-आर्टिफैक्ट मुआवजे की आवश्यकता होती है। विस्तृत घटनाओं की छवि बनाने की क्षमता बढ़ाने के लिए, आधुनिक confocal प्रौद्योगिकी का उपयोग किया जाना चाहिए। इसलिए, एक तेजी से स्कैनिंग z-स्टैक मोटर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि अत्यधिक संवेदनशील कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप33 पर उपलब्ध z-Galvo।
ध्यान दें, यह प्रोटोकॉल तीन मुख्य सीमाओं को प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, विवो में किसी भी दिए गए प्लास्मिड की अभिव्यक्ति / व्यक्त कोशिकाओं की संख्या के स्तर को नियंत्रित करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है। यह एक ही प्लास्मिड एकाग्रता को बनाए रखते हुए भी सभी स्लाइस के बीच परिवर्तनशीलता का परिचय देता है। इसलिए, उपयोग किए गए अभिव्यक्ति वैक्टर में नियामक तत्वों का चयन देखभाल के साथ पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए। दूसरा, झिल्ली आवेषण का उपयोग करके विस्तृत घटनाओं की इमेजिंग वर्तमान में संभव नहीं है। इस दूसरी सीमा को पिछले पैराग्राफ में प्रस्तावित पद्धतिगत अपडेट के साथ दूर किया जा सकता है। अंत में, विकास शंकु अत्यधिक फोटोसेंसिटिव होते हैं और जल्दी से फोटोब्लीच हो सकते हैं। इसलिए, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 5 मिनट के रूप में कम से कम विकास शंकु की लगातार इमेजिंग अक्सर विकास शंकु को ध्वस्त कर सकती है। इस संबंध में, प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी उत्पन्न उपकरणों में नई प्रगति को मस्तिष्क स्लाइस34 की दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस तरह के प्रोटोकॉल को नए शोध मार्गों को खोलने के लिए कल्पना की जाती है, जिससे विकास शंकु को विवो वातावरण में एक जटिल की ओर पढ़ने और प्रतिक्रिया करने के लिए क्या होता है, और अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परिष्कृत इंटरप्ले के यांत्रिकी को उजागर करने के लिए बेहतर समझ मिलती है।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रक्रियाओं की तस्वीर लेने के लिए मारिया यूजेनिया बर्निस को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम एमिली बर्नसाइड, एमिली हैंडली, थोरबेन पिएट्रेला, मैक्स शेल्स्की और सीना स्टर्न को पांडुलिपि को पढ़ने और चर्चा करने के लिए भी धन्यवाद देते हैं। हम अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायकों, जेसिका गोनर, ब्लांका रैंडेल और Anh-Tuan Pham के आभारी हैं। हम DZNE की प्रकाश माइक्रोस्कोप सुविधा और पशु सुविधा के मूल्यवान समर्थन को स्वीकार करते हैं। इस काम को ड्यूश Forschungsgesellschaft (DFG), पैराप्लेजिया (IRP) में अनुसंधान के लिए अंतर्राष्ट्रीय फाउंडेशन, और जीवन के लिए पंख (F.B के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। एफ.B उत्कृष्टता क्लस्टर ImmunoSensation2, SFBs 1089 और 1158 का एक सदस्य है, और रोजर डी Spoelberch पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है।
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Betadine | B. Braun | 3864154 | |
Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
Isoflurane | Virbac | NA | |
Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
Parafilm | VWR | 52858-000 | |
Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
Sucrose | Roth | 4621.2 | |
Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |