Denne protokol præsenterer metodologi til at udføre biofilmvækst- og biomassemålinger ved hjælp af selvmonterede PCR-pladeenheder med dyb brønd til statisk biofilmscreening med høj gennemstrømning af 96-brønds fastgjort låg.
Bakterielle biofilm er vanskelige at udrydde fra overflader ved hjælp af konventionelle antimikrobielle indgreb. Mikroplademetoder med høj gennemstrømning med høj gennemstrømning bruges ofte til at dyrke bakterielle biofilm til hurtig antimikrobiel modtagelighedstest for at beregne minimale værdier for biofilmudryddelseskoncentration (MBEC). Standard biofilmenheder består af polystyrenplukkede låg monteret på 96-brønds mikroplader og er ideelle til måling af biofilmbiomasse og MBEC-værdier, men disse enheder er begrænset af det tilgængelige pindeoverfladeareal til biomasseakkumulering og omkostninger. Her skitserer vi en protokol til brug af selvmonteret polypropylen 96-brønd dyb brønd PCR-plade fastgjort låg enhed til at dyrke Escherichia coli BW25113 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. En sammenligning af 24-timers biofilm dannet på standard- og dybbrøndeanordninger af hver art ved hjælp af krystalviolet biomassefarvning og MBEC-bestemmelsesassays er beskrevet. Det større overfladeareal af dybe brøndanordninger forventedes at øge den samlede biofilmdannelse af begge arter 2-4 gange. P. aeruginosa dannede signifikant større biomasse/mm2 på dybe brøndpinde sammenlignet med standardanordningen. E. coli havde større biomasse / mm2 på standard polystyrenanordninger sammenlignet med dybbrøndeenheden. Biofilm udryddelsesassays med desinfektionsmidler såsom natriumhypochlorit (blegemiddel) eller benzalkoniumchlorid (BZK) viste, at begge forbindelser kunne eliminere E. coli og P. aeruginosa biofilm fra begge enheder, men ved forskellige MBEC-værdier. BZK biofilm udryddelse resulterede i variable E. coli MBEC værdier mellem enheder, men blegemiddel demonstrerede reproducerbare MBEC værdier for både arter og enheder. Denne undersøgelse giver en dyb brøndmetode med høj gennemstrømning til dyrkning af større mængder biofilm på polypropylenanordninger til downstream-undersøgelser, der kræver større mængder statisk biofilm.
Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli er gramnegative proteobakterier, der almindeligvis undersøges for deres evne til at danne sessile, overflade-vedhæftede cellesamfund kendt som biofilm1. Begge arter kan, når de vokser som biofilm, udskille en matrix af ekstracellulære polymere stoffer (EPS), der primært består af forskellige polysaccharider og proteiner, som også kan omfatte ekstracellulært DNA og/eller lipider, hvilket giver ekstra cellulær beskyttelse og forbedret overlevelse i barske, næringsbegrænsede miljøer2,3. Biofilmfysiologi og dannelse af begge arter er af klinisk relevans, da de repræsenterer de fem mest almindeligt isolerede antimikrobielt resistente patogener fra hospitalspatientblod, urinveje og lungeinfektioner i Canada4,5. Det er også vigtigt at bemærke, at biofilm anslås at udgøre næsten 80 % af alle kroniske og tilbagevendende infektioner forårsaget af disse bakteriearter6. På grund af de udskillede EPS-stoffer og langsommere metabolisk aktivitet7,8 bliver etablerede biofilm vanskeligere at udrydde, når de dannes på overflader såsom implanteret medicinsk udstyr, arvæv og i lungerne hos patienter med cystisk fibrose9,10, hvilket øger deres antimikrobielle resistens.
Bakteriebiofilms genstridige vækstegenskaber gør dem ofte mere modstandsdygtige over for antimikrobiel hæmning og/eller udryddelse2,9. Etablering af in vitro-metoder til undersøgelse af antimikrobiel udryddelse af bakteriel biofilm er således af afgørende betydning for udvælgelsen af effektive forbindelser til udryddelse af infektioner, når de dannes på medicinsk plast (f.eks. katetre i boligen) og medicinske implantater. De hurtigste in vitro biofilm antimikrobielle udryddelsesdyrkningsmetoder undersøger biofilmvækst som en “statisk” biofilmkultur snarere end “kontinuerlige” kulturer, hvor statisk bakterievækst overvåges i tidlige til sene stadier af biofilmdannelse over en kort (24-96 h) tidsramme i samme vækstmedium. Kontinuerlige biofilmmetoder er besværlige for hurtig analyse, da de kræver biofilmvækst vurderet over længere tidsrammer dyrket i kamre, der muliggør kontinuerlig strømning og udskiftning af vækstmedier med færre replikater11. På grund af den tid og de kræfter, der kræves for at vedligeholde og etablere kontinuerlige biofilm, er statiske in vitro-biofilm de mest populære, da de let kan tilpasses til antimikrobiel følsomhedstest med høj gennemstrømning i plastiske 96-brønds mikrotiterplader snarere end udførlige flowkammersystemer, der begrænser antallet af kulturer, der testes samtidigt 12,13 . De enkleste statiske “in-well” biofilmmikropladeassays bruger standard polystyren eller vinyl (300 μL kapacitet) mikrotiterplader til at måle biofilmdannelse på siderne og bunden af hver brønd og ofte som ringe ved luft til flydende overfladegrænseflade. Bakteriel biofilmdannelse i brønden måles ved farvning af den deponerede biomasse, der klæbes til brøndene, efter at vækstmediets væske er fjernet, og biofilmene er vasket12,13. Disse analyser er økonomisk populære, men har ofte reproducerbarhedsproblemer på grund af deres iboende design, da deponerede biofilm er tilbøjelige til at beskadige eller tabe under skylning til cellegenvinding og biomassefarvningsprocedurer11,14.
For at reducere biofilmtab har standard kommercielle biofilmenheder forbedret biofilmmikropladedesign i brønden ved at tilføje et indsætteligt 96-brønds fastgjort polystyrenlåg til standard 96 in-well pladedesign, kaldet “standard biofilm-enheden” heri. Tilføjelsen af et fastgjort låg udvider det tilgængelige overfladeareal i hver mikropladebrønde, hvilket giver mulighed for forbedret overfladeadhærens og dannelse af biofilmbiomasse15,16. Standard biofilm fastgjort låg enheder giver mulighed for større biofilm opsving, fjernelse og skylning til efterfølgende antimikrobielle biofilm modtagelighed og udryddelse test, når fastgjort låg indsættes i nye mikrotiter plader indeholdende lægemiddel eller vækst tilstand udfordringer. I lighed med biofilmmikropladeteknikker i brønden giver de genvundne materialer fra de fjernede og vaskede fastgjorte låganordninger mulighed for celleoverlevelsestest og biofilmbiomassefarvning, der typisk involverer krystalviolette (CV) farvestofformuleringer 17,18,19. Standard biofilmudstyr er også optimalt til screening af biofilm antimikrobielle følsomheder. Disse analyser overvåger biofilmvæksthæmning på to måder: 1) Når antimikrobielle stoffer tilsættes til celler i starten af væksten, kan det bestemme den mindste biofilmhæmningskoncentration (MBIC) værdi. 2) Når etablerede biofilm dannes på pløkkerne efter 24 timer og derefter eksponeres for antibiotika, kan den bestemme minimumsværdien for biofilmudryddelse (MBEC) 17,20. I lighed med biofilmmikropladeenheder i brønden har standard biofilmenheder nogle bemærkelsesværdige begrænsninger, såsom deres høje omkostninger pr. Enhed, de er ikke-autoklaverbare og mindre holdbare over for kemiske opløsningsmidler på grund af det anvendte polystyrenplademateriale. Standard biofilmenheder har også et lavt overfladeareal til pindeforhold, hvilket begrænser de maksimale arbejdsvolumener i hver brønd til 200 μL. Disse faktorer kan gøre standard biofilmenheder mere udfordrende at bruge til undersøgelser, der kræver større mængder biofilm i et format med høj gennemstrømning.
Her beskriver vi en statisk biofilm pegged-lid 96-well metode udviklet i vores laboratorium ved hjælp af kommercielt tilgængelige polypropylen semi-skirted 0,5 ml 96-brønd PCR plader monteret på 96-brønd mikrotiter plader med brønde dybere end standardpladen (Table of Materials). Disse samlede enheder har et maksimalt arbejdsvolumen på 750 μL, når de anvendes til dyrkning af biofilm (i det følgende kendt som “dyb brøndbiofilmenhed”). Fordelene ved at bruge disse dybe brøndbiofilmenheder er deres lavere omkostninger sammenlignet med standard biofilmenheder, de kan steriliseres ved autoklavering, og de øger overfladearealet til biofilmdannelse på den større eksterne PCR-plade “rør / pinde”. Med denne metode viser vi anvendelserne af disse enheder til dyrkning og karakterisering af biofilmbiomasse dannet af Escherichia coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1. Metoder til bestemmelse af MBEC-værdier ved hjælp af biofilmudryddelsesassays beskrives ved anvendelse af det kvaternære ammoniumforbindelsesdesinfektionsmiddel benzalkoniumchlorid (BZK) og natriumhypochlorit (blegemiddel) antimikrobielle stoffer. Det antiseptiske/desinfektionsmiddel BZK blev valgt, da denne forbindelse ofte bruges til at hæmme biofilm fra forurenede overflader, men det er angiveligt mindre effektivt til at udrydde veletablerede biofilm21. Blegemiddel er et yderst effektivt kemikalie til udryddelse af etablerede biofilm og er en grundpille i kemisk desinfektion 22. Begge desinfektionsmidler giver en nyttig sammenligning af MBEC-værdier for hver biofilmenhed21. En protokol til denne biofilmenhedsvurdering ved hjælp af CV-farvning og biofilmudryddelsesassays til MBEC-bestemmelse er opsummeret i denne artikel. Der er medtaget et protokolflowdiagram for at få et forenklet overblik over arbejdsgangen for disse metoder (figur 1).
Denne undersøgelse beskriver metoder til anvendelse af en statisk biofilmvækstanordning med større volumen på 96 brønde med høj gennemstrømning, der involverer en polypropylen dyb brøndmikroplade udstyret med et halvskørtet PCR-pladelåg til biofilmdannelse (dyb brøndbiofilmenhed; Tabel over materialer). Vi sammenlignede biofilm genereret med denne enhed med en kommercielt tilgængelig polystyrenstandard biofilmenhed (Table of Materials). Metoden med dyb brøndanordning bruger de samme metodologiske trin og løsninger som standardenheden17 ved justerede volumener, der er modificeret til enhederne med dybe brønde, hvilket gør denne enhed ideel til biofilmdannelse og eksperimentel analyse i stor skala. Væksten af E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1, to gramnegative arter, der vides at danne biofilm, blev undersøgt for deres biomassedannelse og desinfektionsmiddel (BZK / blegemiddel) MBEC-værdier ved anvendelse på begge enheder. Sammenligning af CV-farvet biomasse dannet på pinde fra hver enhed viste, at både E. coli og P. aeruginosa dannede biofilm med højere biomasse på biofilmenheden med dyb brønd sammenlignet med standardanordningen (figur 3A-B). Øget biofilmbiomasse afspejlede det større overfladeareal af dybe brøndpinde sammenlignet med standardindretningens pindeoverfladeareal. Da vi redegjorde for forskelle i pindeoverfladearealer (mm2) med begge enheder, blev der konstateret forskelle i biomassedannelse, hvor E. coli dannede signifikant større CV-biomasse pr. mm2 på polystyrenstandardanordningspinde end med den dybe brøndanordnings PCR-rørpinde (tabel 1). P. aeruginosa dannede større CV-farvet biomasse / pind mm2 sammenlignet med standardenheder (tabel 1). Disse resultater kan fremhæve artsspecifikke forskelle i dannelsen af biofilmbiomasse på de forskellige enheder.
Det skal bemærkes, at blegemiddeludryddelse af E. coli og P. aeruginosa biofilm på dybe brøndindretninger forekom ved 2-4 gange lavere koncentrationer end standardanordning (figur 4A-B, tabel 1). Forskellene i blegemiddel MBEC-værdier, der er identificeret fra hver enhed, påvirkes sandsynligvis af forskelle i enhedens pindeformer (dybe brønde “pinde” er koniske rør og standardpinde er cylindriske), plastsammensætningsforskelle (polypropylen versus polystyren) og volumenforskelle (750 μL versus 200 μL). For eksempel havde P. aeruginosa større CV M-biomasse / mm2 på dybe brøndanordningspinde sammenlignet med standardenheder, men E. coli havde mindre biomasse på dybe brøndpinde (figur 3). Dette tyder på, at de desinfektionsmiddelkoncentrationer, der kræves til udryddelse af biofilm, kan påvirkes af den biomasse, der dannes af hver art, samt det tilgængelige overfladeareal. Derudover kan forskelle i enhedens pindeform påvirke forskellige vækstbetingelser for bestemte arter. I vores undersøgelse kan P. aeruginosa danne større biomasse på dybe brøndpinde på grund af deres større overfladeareal og beluftning, da denne art er en obligatorisk aerobe i modsætning til E. coli, som er en fakultativ anaerobe. Til dato har vi ikke identificeret nogen offentliggjorte undersøgelser, der direkte har sammenlignet E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse sammen på både polypropylen27,28,29 og polystyren30,31 materialer. Rapporter om robust E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse er imidlertid blevet noteret i uafhængige undersøgelser, der undersøger enten polypropylen- eller polystyrenmaterialer. Med hensyn til pseudomoneder kan mange Pseudomonas spp. anvende plast såsom polypropylen som potentielle kulstofkilder32. Derfor er tilgængeligheden af denne polypropylen dyb brønd biofilm enhed et nyttigt fremskridt i statiske biofilmstudier. Polypropylen er kemisk mere holdbart end polystyren og er et klinisk relevant materiale, da det ofte anvendes i medicinske implantater, suturer og masker til brok- eller bækkenoperationer33,34.
Selvom biofilmbiomasse blev dannet af begge enheder, havde den dybe brøndanordning lidt højere variabilitet i biomasse baseret på CV-farvningsmetoden og OD600nm biofilmudryddelse MBEC-værdier for blegemiddel og BZK. Dette kan forklares med 3 hovedfaktorer: 1) Dybe brøndanordninger har større pindeoverfladeareal end standardanordninger, der var vinklede sammenlignet med standardindretningspind. 2) Begge testede arter kan have forskellige evner til at klæbe til polypropylen- og polystyrenmaterialer i hver enhed. 3) Mængderne af vækstmedier, der anvendes i hver enhed (750 μL dyb brønd, 200 μL standard) og afstanden mellem den indsatte pind til brøndens sidevægge er forskellig. Disse problemer er ikke et problem, hvis der kun bruges en type enhed til alle biofilmeksperimenter, men hvis begge enheder vælges, skal de sammenligninger, vi gennemførte heri, udføres for at identificere forskelle36,37. På grund af forskellene i plastmateriale, der anvendes i hver enhed, bør CV-farvet biofilmbiomasse og MBEC-værdier ikke sammenlignes direkte mellem forskellige enheder. Hvis metoder og forsøg udføres på samme udstyr (dyb brønd eller standard), er de opnåede resultater for de testede arter og antimikrobielle stoffer imidlertid sammenlignelige.
Denne protokol viser, at selvmonterede PCR-pladeenheder med dyb brønd er biofilmanordning med større volumen til måling af biofilmdannelse og udryddelse, der også er omkostningseffektiv. Fra et omkostningsperspektiv varierer standard biofilmenheder med et 96 godt fastgjort låg detailhandel til $ 29-36 amerikanske dollars (USD) pr. Enhed (Table of Materials). Polystyren standard biofilm enheder er ikke autoklaverbare og er mindre tolerante over for opløsningsmidler / syrer på grund af dets plastiske kemiske egenskaber. De selvmonterede polypropylen dybe brøndplader, der er beskrevet heri, udstyret med en separat halvskørtet 96 brønd PCR-plade (Table of Materials) koster i alt $ 14 USD pr. Samlet enhed, hvilket er halvdelen af standard biofilmenhedens omkostninger. Det skal bemærkes, at priserne kan variere afhængigt af region, distributør og tilgængelighed, og vores omkostninger efter institutionelle rabatter udarbejdet til $ 9 USD / dyb brøndenhed. Disse selvmonterede PCR-pladeenheder af dyb brønd polypropylen har den ekstra fordel, at de kan autoklaveres til sterilisering og tilbyder 2-4 gange mere biofilmbiomasse end standardenheder.
Afslutningsvis viser denne protokol og de repræsentative resultater fra biofilmvækstsammenligninger af den dybe brønd og standard biofilmenheder, at begge enheder er i stand til at dyrke bakterielle biofilm, men dybe brøndenheder danner 2-4 gange mere biofilm. Den dybe brøndbiofilmenhed tilbyder et levedygtigt og overkommeligt alternativ til biofilmdannelsesforsøg med større volumen med høj gennemstrømning såsom screeningsundersøgelser for lægemiddelmodtagelighed. Denne teknik kan generere biofilm, der er nyttige til downstream-‘omics’-ekstraktioner (proteomiske, metabolomiske, transkriptomiske) eller eksperimentelle assays (enzymatiske, fluorescerende), der kan kræve større mængder biofilmmaterialer til analyser. Den dybe brønd biofilm enhed anbefales til laboratorier, der gerne vil studere biofilm i en høj gennemstrømning 96-brønds assay ved hjælp af billigere, større volumen, kemisk holdbare plastmaterialer, der er klinisk relevante.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette arbejde blev ydet af driftstilskud til DCB fra Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2016-05891) og til MRM og GRG fra Government of Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) -programmet (GRDI7 2254557).
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | — | materials for deepwell device sterilization |
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |