यह प्रोटोकॉल बायोफिल्म विकास और बायोमास माप करने के लिए पद्धति प्रस्तुत करता है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट 96-अच्छी तरह से पेग किए गए ढक्कन स्थैतिक बायोफिल्म स्क्रीनिंग के लिए स्व-इकट्ठा गहरी अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट उपकरणों का उपयोग किया जाता है।
बैक्टीरियल बायोफिल्म्स को पारंपरिक रोगाणुरोधी हस्तक्षेपों का उपयोग करके सतहों से मिटाना मुश्किल है। उच्च-थ्रूपुट 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट विधियों का उपयोग अक्सर कम से कम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता (MBEC) मूल्यों की गणना करने के लिए तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए बैक्टीरियल बायोफिल्म्स की खेती करने के लिए किया जाता है। मानक बायोफिल्म उपकरणों में पॉलीस्टीरीन पेग्ड-ढक्कन होते हैं जो 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेटों में फिट होते हैं और बायोफिल्म बायोमास और एमबीईसी मूल्यों को मापने के लिए आदर्श होते हैं, लेकिन ये उपकरण बायोमास संचय और लागत के लिए उपलब्ध खूंटी सतह क्षेत्र द्वारा सीमित होते हैं। यहां, हम स्व-इकट्ठे पॉलीप्रोपाइलीन 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट पेग्ड-ढक्कन डिवाइस का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं ताकि एस्चेरिचिया कोलाई बीडब्ल्यू 25113 और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा पीएओ 1 बायोफिल्म्स विकसित किया जा सके। क्रिस्टल वायलेट बायोमास धुंधला और MBEC निर्धारण assays का उपयोग कर प्रत्येक प्रजाति द्वारा मानक और गहरी अच्छी तरह से उपकरणों पर गठित 24 घंटे biofilms की तुलना का वर्णन कर रहे हैं. गहरी अच्छी तरह से उपकरणों के बड़े सतह क्षेत्र ने उम्मीद की थी कि दोनों प्रजातियों द्वारा समग्र बायोफिल्म गठन में 2-4 गुना वृद्धि हुई है। पी एरुगिनोसा ने मानक डिवाइस की तुलना में गहरे कुएं के खूंटे पर काफी अधिक बायोमास / एमएम 2 का गठन किया। ई कोलाई में गहरे कुएं के उपकरण की तुलना में मानक पॉलीस्टीरीन उपकरणों पर अधिक बायोमास / एमएम 2 था। सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) या बेंजाल्कोनियम क्लोराइड (बीजेडके) जैसे कीटाणुनाशकों के साथ बायोफिल्म उन्मूलन assays से पता चला है कि दोनों यौगिक दोनों उपकरणों से ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स को खत्म कर सकते हैं, लेकिन अलग-अलग एमबीईसी मूल्यों पर। BZK बायोफिल्म उन्मूलन के परिणामस्वरूप उपकरणों के बीच चर ई कोलाई MBEC मूल्यों में परिणाम हुआ, हालांकि, ब्लीच ने प्रजातियों और उपकरणों दोनों के लिए पुनरुत्पादक MBEC मूल्यों का प्रदर्शन किया। यह अध्ययन डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए पॉलीप्रोपाइलीन उपकरणों पर बायोफिल्म की बड़ी मात्रा में वृद्धि के लिए एक उच्च थ्रूपुट डीप वेल विधि प्रदान करता है जिसमें उच्च मात्रा में स्थैतिक बायोफिल्म की आवश्यकता होती है।
स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एस्चेरिचिया कोलाई ग्राम-नकारात्मक प्रोटिओबैक्टीरिया हैं जो आमतौर पर बायोफिल्म्स 1 के रूप में जाने जाने वाले सेसिल, सतह से जुड़े सेल समुदायों को बनाने की उनकी क्षमता के लिए अध्ययन किए जाते हैं। दोनों प्रजातियां, जब बायोफिल्म्स के रूप में बढ़ती हैं, तो मुख्य रूप से विभिन्न पॉलीसेकेराइड और प्रोटीन से बने एक्स्ट्रासेल्युलर पॉलिमेरिक पदार्थों (ईपीएस) के मैट्रिक्स का स्राव कर सकती हैं, जिसमें एक्स्ट्रासेल्युलर डीएनए और / या लिपिड भी शामिल हो सकते हैं, जो अतिरिक्त सेलुलर सुरक्षा प्रदान करते हैं और कठोर, पोषक तत्व-सीमित वातावरण में बढ़ी हुई उत्तरजीविता प्रदान करते हैं2,3। बायोफिल्म फिजियोलॉजी और दोनों प्रजातियों द्वारा गठन नैदानिक प्रासंगिकता का है, क्योंकि वे कनाडा में अस्पताल के रोगी रक्त, मूत्र पथ और फेफड़ों के संक्रमण से शीर्ष पांच सबसे अधिक अलग-थलग रोगाणुरोधी प्रतिरोधी रोगजनकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बायोफिल्म्स को इन जीवाणु प्रजातियों के कारण होने वाले सभी पुराने और आवर्तक संक्रमणों का लगभग 80% बनाने का अनुमान है। स्रावित ईपीएस पदार्थों और धीमी चयापचय गतिविधि 7,8 के कारण, स्थापित बायोफिल्म्स को मिटाना अधिक कठिन हो जाता है जब वे प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों, निशान ऊतकों और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के फेफड़ों में सतहों पर बनते हैं9,10, उनके रोगाणुरोधी प्रतिरोध को जोड़ते हैं।
बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के अड़ियल विकास गुण अक्सर उन्हें रोगाणुरोधी निषेध और / या उन्मूलन 2,9 के लिए अधिक प्रतिरोधी बनाते हैं। इस प्रकार, बैक्टीरियल बायोफिल्म रोगाणुरोधी उन्मूलन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो विधियों की स्थापना संक्रमण को खत्म करने के लिए प्रभावी यौगिकों का चयन करने के लिए सर्वोपरि है जब वे चिकित्सा प्लास्टिक (जैसे, इन-निवास कैथेटर) और चिकित्सा प्रत्यारोपण पर बनते हैं। सबसे तेजी से इन विट्रो बायोफिल्म रोगाणुरोधी उन्मूलन संस्कृति के तरीके “निरंतर” संस्कृतियों के बजाय “स्थिर” बायोफिल्म संस्कृति के रूप में बायोफिल्म विकास की जांच करते हैं, जहां स्थिर जीवाणु विकास की निगरानी एक ही विकास माध्यम में एक छोटी (24-96 ज) समय सीमा पर बायोफिल्म गठन के शुरुआती से देर के चरणों में की जाती है। निरंतर बायोफिल्म विधियां तेजी से विश्लेषण के लिए बोझिल हैं क्योंकि उन्हें कक्षों में उगाए गए लंबे समय तक बायोफिल्म विकास की आवश्यकता होती है जो कम प्रतिकृतियों के साथ विकास मीडिया के निरंतर प्रवाह और प्रतिस्थापन की अनुमति देते हैं। निरंतर बायोफिल्म्स को बनाए रखने और स्थापित करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास के कारण, स्थैतिक इन विट्रो बायोफिल्म्स सबसे लोकप्रिय हैं, क्योंकि वे आसानी से प्लास्टिक 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेटों में उच्च-थ्रूपुट रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए अनुकूलित होते हैं, बजाय विस्तृत प्रवाह कक्ष प्रणालियों के जो संस्कृतियों की संख्या को सीमित करते हैं एक साथ परीक्षण किए गए 12,13 . सबसे सरल स्थैतिक “इन-वेल” बायोफिल्म माइक्रोप्लेट assays मानक polystyrene या vinyl (300 μL क्षमता) माइक्रोटिटर प्लेटों का उपयोग करने के लिए पक्षों और प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे biofilm गठन को मापने के लिए और अक्सर तरल सतह इंटरफ़ेस के लिए हवा में छल्ले के रूप में। बैक्टीरियल इन-वेल बायोफिल्म गठन को विकास माध्यम तरल को हटाने और बायोफिल्म्स को धोने के बाद कुओं का पालन करने वाले जमा बायोमास को धुंधला करके मापा जाता है12,13। ये assays आर्थिक रूप से लोकप्रिय हैं, लेकिन अक्सर उनके अंतर्निहित डिजाइन के कारण reproducibility मुद्दों है, के रूप में जमा biofilms सेल वसूली और बायोमास धुंधला प्रक्रियाओं के लिए rinsing के दौरान क्षति या नुकसान के लिए प्रवण हैं11,14.
बायोफिल्म नुकसान को कम करने के लिए, मानक वाणिज्यिक बायोफिल्म उपकरणों ने मानक 96 इन-वेल प्लेट डिजाइन में एक डालने योग्य 96-अच्छी तरह से पेग किए गए पॉलीस्टीरीन ढक्कन को जोड़कर इन-वेल बायोफिल्म माइक्रोप्लेट डिजाइनों में सुधार किया है, जिसे “मानक बायोफिल्म डिवाइस” के रूप में जाना जाता है। एक pegged ढक्कन के अलावा प्रत्येक माइक्रोप्लेट अच्छी तरह से में उपलब्ध सतह क्षेत्र का विस्तार करता है, बढ़ाया सतह पालन और biofilm बायोमास गठन के लिए अनुमति देता है15,16. मानक बायोफिल्म पेग्ड ढक्कन उपकरण बाद के रोगाणुरोधी बायोफिल्म संवेदनशीलता और उन्मूलन परीक्षण के लिए अधिक से अधिक बायोफिल्म वसूली, हटाने और धोने की अनुमति देते हैं जब पेग किए गए ढक्कन को दवा या विकास की स्थिति की चुनौतियों वाले नए माइक्रोटिटर प्लेटों में डाला जाता है। इन-वेल बायोफिल्म माइक्रोप्लेट तकनीकों के समान, हटाए गए और धोए गए पेग किए गए ढक्कन उपकरणों से बरामद सामग्री सेल अस्तित्व परीक्षण और बायोफिल्म बायोमास स्टेनिंग के लिए अनुमति देती है, जिसमें आमतौर पर क्रिस्टल वायलेट (सीवी) डाई फॉर्मूलेशन शामिल होते हैं 17,18,19। मानक बायोफिल्म उपकरण भी बायोफिल्म रोगाणुरोधी संवेदनशीलता की स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम हैं। ये assays दो तरीकों से biofilm विकास निषेध की निगरानी करते हैं: 1) जब रोगाणुरोधी को विकास की शुरुआत में कोशिकाओं में जोड़ा जाता है, तो यह न्यूनतम बायोफिल्म निषेध एकाग्रता (MBIC) मूल्य निर्धारित कर सकता है। 2) जब स्थापित बायोफिल्म्स 24 घंटे के बाद खूंटे पर बनते हैं और फिर रोगाणुरोधी के संपर्क में आते हैं, तो यह न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता (MBEC) मूल्य 17,20 निर्धारित कर सकता है। इन-वेल बायोफिल्म माइक्रोप्लेट उपकरणों के समान, मानक बायोफिल्म उपकरणों में कुछ उल्लेखनीय सीमाएं होती हैं, जैसे कि प्रति डिवाइस उनकी उच्च लागत, वे गैर-स्व-स्व-दावा योग्य हैं, और पॉलीस्टीरीन प्लेट सामग्री के कारण रासायनिक सॉल्वैंट्स के लिए कम टिकाऊ हैं। मानक बायोफिल्म उपकरणों में खूंटी अनुपात के लिए एक कम सतह क्षेत्र भी होता है, जो प्रत्येक कुएं में अधिकतम काम करने की मात्रा को 200 μL तक सीमित करता है। ये कारक मानक बायोफिल्म उपकरणों को उन अध्ययनों के लिए उपयोग करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं जो उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में बायोफिल्म की अधिक मात्रा की मांग करते हैं।
यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीप्रोपाइलीन अर्ध-स्कर्ट 0.5 एमएल 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेटों का उपयोग करके हमारी प्रयोगशाला में विकसित एक स्थिर बायोफिल्म पेग्ड-ढक्कन 96-अच्छी तरह से विधि का वर्णन करते हैं, जो मानक प्लेट (सामग्री की तालिका) से गहरे कुएं वाले कुओं वाले 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों में फिट होती हैं। इन इकट्ठे किए गए उपकरणों में 750 μL की अधिकतम काम करने की मात्रा होती है जब इसका उपयोग बढ़ते बायोफिल्म के लिए किया जाता है (यहां “डीप वेल बायोफिल्म डिवाइस” के रूप में जाना जाता है)। इन गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म उपकरणों का उपयोग करने के फायदे मानक बायोफिल्म उपकरणों की तुलना में उनकी कम लागत हैं, उन्हें ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल किया जा सकता है, और वे बड़े बाहरी पीसीआर-प्लेट “ट्यूब / पेग्स” पर बायोफिल्म गठन के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाते हैं। इस विधि के साथ हम बढ़ते और Escherichia कोलाई BW25113 और पी. aeruginosa PAO1 द्वारा गठित biofilm बायोमास की विशेषता के लिए इन उपकरणों के अनुप्रयोगों को दिखाने. बायोफिल्म उन्मूलन assays का उपयोग कर MBEC मूल्यों को निर्धारित करने के तरीकों को चतुर्भुज अमोनियम यौगिक कीटाणुनाशक benzalkonium क्लोराइड (BZK) और सोडियम hypochlorite (ब्लीच) रोगाणुरोधी का उपयोग कर वर्णित कर रहे हैं। एंटीसेप्टिक / कीटाणुनाशक बीजेडके का चयन किया गया था क्योंकि इस यौगिक का उपयोग अक्सर दूषित सतहों से बायोफिल्म्स को बाधित करने के लिए किया जाता है, लेकिन यह अच्छी तरह से स्थापित बायोफिल्म्स 21 को खत्म करने में कथित तौर पर कम प्रभावी है। ब्लीच स्थापित बायोफिल्म्स के उन्मूलन के लिए एक अत्यधिक प्रभावी रसायन है और रासायनिक कीटाणुशोधन 22 में एक मुख्य आधार है। दोनों कीटाणुनाशक प्रत्येक बायोफिल्म डिवाइस 21 के लिए MBEC मूल्यों की एक उपयोगी तुलना प्रदान करते हैं। इस biofilm डिवाइस मूल्यांकन के लिए CV धुंधला और MBEC निर्धारण के लिए biofilm उन्मूलन assays का उपयोग कर के लिए एक प्रोटोकॉल इस लेख में संक्षेप में है. इन विधियों के लिए वर्कफ़्लो के सरलीकृत अवलोकन के लिए एक प्रोटोकॉल फ़्लोचार्ट शामिल किया गया है (चित्र1).
यह अध्ययन एक बड़ी मात्रा 96-अच्छी तरह से उच्च थ्रूपुट स्थैतिक बायोफिल्म विकास डिवाइस का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन करता है जिसमें एक पॉलीप्रोपाइलीन गहरी अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट शामिल है जो बायोफिल्म गठन (गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस) के लिए अर्ध-स्कर्ट वाले पीसीआर-प्लेट ढक्कन के साथ फिट होता है; सामग्री की तालिका)। हमने इस डिवाइस के साथ उत्पन्न बायोफिल्म्स की तुलना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीस्टीरीन मानक बायोफिल्म डिवाइस (सामग्री की तालिका) से की। गहरी अच्छी तरह से डिवाइस विधि मानक device17 के रूप में एक ही methodological चरणों और समाधान का उपयोग करता है समायोजित मात्रा में गहरे अच्छी तरह से उपकरणों के लिए संशोधित, इस डिवाइस को बड़े पैमाने पर biofilm गठन और प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए आदर्श बनाने. ई कोलाई BW25113 और P. aeruginosa PAO1, दो ग्राम-नकारात्मक प्रजातियां जो बायोफिल्म बनाने के लिए जानी जाती हैं, की वृद्धि, दोनों उपकरणों पर उपयोग करके उनके बायोमास गठन और कीटाणुनाशक (BZK / bleach) MBEC मूल्यों के लिए जांच की गई थी। प्रत्येक डिवाइस से खूंटे पर गठित सीवी-दाग बायोमास की तुलना से पता चला है कि ई कोलाई और पी एरुगिनोसा दोनों ने मानक डिवाइस (चित्रा 3 ए-बी) की तुलना में गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस पर उच्च बायोमास के साथ बायोफिल्म्स का गठन किया। बढ़ी हुई बायोफिल्म बायोमास ने मानक डिवाइस खूंटी सतह क्षेत्र की तुलना में गहरे कुएं के खूंटे के बड़े सतह क्षेत्र को प्रतिबिंबित किया। जब हम दोनों उपकरणों के साथ खूंटी सतह क्षेत्रों (मिमी 2) में अंतर के लिए जिम्मेदार थे, तो बायोमास गठन में अंतर नोट किया गया था, जहां ई कोलाई ने गहरे कुएं डिवाइस के पीसीआर-ट्यूब खूंटे (तालिका 1) की तुलना में पॉलीस्टीरीन मानक डिवाइस खूंटे पर प्रति एमएम 2 प्रति सीवी बायोमास का गठन किया था। पी एरुगिनोसा ने मानक उपकरणों की तुलना में अधिक सीवी-सना हुआ बायोमास / खूंटी एमएम 2 का गठन किया (तालिका 1)। ये निष्कर्ष विभिन्न उपकरणों पर बायोफिल्म बायोमास गठन में प्रजातियों-विशिष्ट अंतरों को उजागर कर सकते हैं।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि गहरे अच्छी तरह से उपकरणों पर ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स का ब्लीच उन्मूलन मानक डिवाइस (चित्रा 4 ए-बी, तालिका 1) की तुलना में 2-4 गुना कम सांद्रता पर हुआ। प्रत्येक डिवाइस से पहचाने गए ब्लीच एमबीईसी मूल्यों में अंतर संभवतः डिवाइस खूंटी आकार में अंतर से प्रभावित होते हैं (गहरी अच्छी तरह से “खूंटे” पतले ट्यूब होते हैं और मानक खूंटे बेलनाकार होते हैं), प्लास्टिक संरचना अंतर (पॉलीप्रोपाइलीन बनाम पॉलीस्टीरीन), और मात्रा अंतर (750 μL बनाम 200 μL)। उदाहरण के लिए, मानक उपकरणों की तुलना में पी. एरुगिनोसा में गहरे कुएं के डिवाइस खूंटे पर अधिक सीवी एम बायोमास / एमएम 2 था, लेकिन ई कोलाई में गहरे कुएं के खूंटे (चित्रा 3) पर कम बायोमास था। इससे पता चलता है कि बायोफिल्म उन्मूलन के लिए आवश्यक कीटाणुनाशक सांद्रता प्रत्येक प्रजाति के साथ-साथ उपलब्ध सतह क्षेत्र द्वारा गठित बायोमास से प्रभावित हो सकती है। इसके अतिरिक्त, डिवाइस खूंटी आकार में अंतर विशेष प्रजातियों के लिए विभिन्न विकास स्थितियों को प्रभावित कर सकता है। हमारे अध्ययन में, पी एरुगिनोसा अपने अधिक सतह क्षेत्र और वातन के कारण गहरे कुएं के खूंटे पर अधिक बायोमास बना सकता है, क्योंकि यह प्रजाति ई कोलाई के विपरीत एक बाध्य एयरोब है, जो एक संकाय एनारोब है। आज तक, हमने किसी भी प्रकाशित अध्ययन की पहचान नहीं की है जिसने सीधे ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म गठन की तुलना पॉलीप्रोपाइलीन 27,28,29 और पॉलीस्टीरीन 30,31 सामग्रियों दोनों पर की है। हालांकि, मजबूत ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म गठन की रिपोर्टों को पॉलीप्रोपाइलीन या पॉलीस्टीरीन सामग्री की जांच करने वाले स्वतंत्र अध्ययनों में नोट किया गया है। स्यूडोमोनाड्स के संबंध में, कई स्यूडोमोनास एसपीपी संभावित कार्बन स्रोतों के रूप में पॉलीप्रोपाइलीन जैसे प्लास्टिक का उपयोग कर सकते हैं32। इसलिए, इस पॉलीप्रोपाइलीन डीप वेल बायोफिल्म डिवाइस की उपलब्धता स्थैतिक बायोफिल्म अध्ययन में एक उपयोगी अग्रिम है। पॉलीप्रोपाइलीन पॉलीस्टीरीन की तुलना में रासायनिक रूप से अधिक टिकाऊ है और एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक सामग्री है, क्योंकि इसका उपयोग अक्सर हर्निया या श्रोणि सर्जरी के लिए चिकित्सा प्रत्यारोपण, टांके और meshes में किया जाता है33,34।
यद्यपि बायोफिल्म बायोमास दोनों उपकरणों द्वारा बनाया गया था, गहरी अच्छी तरह से डिवाइस में सीवी स्टेनिंग विधि और OD600nm बायोफिल्म उन्मूलन एमबीईसी मूल्यों के आधार पर बायोमास में थोड़ी अधिक परिवर्तनशीलता थी ब्लीच और बीजेडके के लिए। इसे 3 मुख्य कारकों द्वारा समझाया जा सकता है: 1) डीप वेल उपकरणों में मानक उपकरणों की तुलना में अधिक खूंटी सतह क्षेत्र होता है जो मानक डिवाइस खूंटे की तुलना में कोण थे। 2) परीक्षण की गई दोनों प्रजातियों में प्रत्येक डिवाइस के पॉलीप्रोपाइलीन और पॉलीस्टीरीन सामग्री का पालन करने के लिए अलग-अलग क्षमताएं हो सकती हैं। 3) प्रत्येक डिवाइस (750 μL गहरी अच्छी तरह से, 200 μL मानक) में उपयोग किए जाने वाले विकास मीडिया की मात्रा और अच्छी तरह से साइड दीवारों पर डाले गए खूंटी के बीच की दूरी अलग-अलग होती है। ये मुद्दे एक समस्या नहीं हैं यदि सभी बायोफिल्म प्रयोगों के लिए केवल एक प्रकार के डिवाइस का उपयोग किया जाता है, हालांकि, यदि दोनों उपकरणों का चयन किया जाता है तो हमारे द्वारा यहां आयोजित तुलनाओं को मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जाना चाहिए36,37। प्रत्येक डिवाइस में उपयोग की जाने वाली प्लास्टिक सामग्री में अंतर के कारण, सीवी-दाग वाले बायोफिल्म बायोमास और एमबीईसी मूल्यों की तुलना सीधे विभिन्न उपकरणों के बीच नहीं की जानी चाहिए। हालांकि, यदि विधियों और प्रयोगों को एक ही डिवाइस (गहरी अच्छी तरह से या मानक) पर आयोजित किया जाता है, तो परीक्षण की गई प्रजातियों और रोगाणुरोधी के लिए प्राप्त परिणाम तुलनीय हैं।
इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि स्व-इकट्ठा गहरे अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट डिवाइस बायोफिल्म गठन और उन्मूलन को मापने के लिए बड़ी मात्रा में बायोफिल्म डिवाइस हैं जो लागत प्रभावी भी है। एक लागत परिप्रेक्ष्य से, एक 96 अच्छी तरह से pegged ढक्कन के साथ मानक biofilm उपकरणों $ 29-36 अमेरिकी डॉलर (अमरीकी डालर) प्रति डिवाइस (सामग्री की तालिका) पर खुदरा रेंज. Polystyrene मानक biofilm उपकरण autoclavable नहीं हैं और अपने प्लास्टिक रासायनिक गुणों के कारण सॉल्वैंट्स / एसिड के लिए कम सहिष्णु हैं। स्व-इकट्ठे पॉलीप्रोपाइलीन गहरे कुएं प्लेटों को यहां वर्णित किया गया है, जो एक अलग अर्ध-स्कर्ट वाले 96 अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट (सामग्री की तालिका) के साथ फिट है, जिसकी कुल लागत $ 14 अमरीकी डालर प्रति इकट्ठे डिवाइस है, जो मानक बायोफिल्म डिवाइस लागत का आधा है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कीमतें क्षेत्र, वितरक और उपलब्धता के आधार पर भिन्न हो सकती हैं, और संस्थागत छूट के बाद हमारी लागत $ 9 अमरीकी डालर / गहरी अच्छी तरह से डिवाइस पर काम करती है। इन स्व-इकट्ठे गहरे अच्छी तरह से पॉलीप्रोपाइलीन पीसीआर-प्लेट उपकरणों में नसबंदी के लिए ऑटोक्लेवेबल होने का अतिरिक्त लाभ है और मानक उपकरणों की तुलना में 2-4 गुना अधिक बायोफिल्म बायोमास प्रदान करता है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल और गहरे कुएं और मानक बायोफिल्म उपकरणों की बायोफिल्म विकास तुलना से प्रतिनिधि निष्कर्ष बताते हैं कि दोनों उपकरण बैक्टीरियल बायोफिल्म की खेती करने में सक्षम हैं, लेकिन गहरे अच्छी तरह से उपकरण 2-4 गुना अधिक बायोफिल्म बनाते हैं। गहरी अच्छी तरह से biofilm डिवाइस इस तरह के दवा संवेदनशीलता स्क्रीनिंग अध्ययन के रूप में बड़ी मात्रा में उच्च थ्रूपुट biofilm गठन प्रयोगों के लिए एक व्यवहार्य और सस्ती विकल्प प्रदान करता है। यह तकनीक डाउनस्ट्रीम ‘-ओमिक्स’ निष्कर्षण (प्रोटिओमिक, मेटाबोलोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक) या प्रयोगात्मक assays (एंजाइमेटिक, फ्लोरोसेंट) के लिए उपयोगी बायोफिल्म उत्पन्न कर सकती है, जिसके लिए विश्लेषण के लिए बायोफिल्म सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। गहरी अच्छी तरह से biofilm डिवाइस प्रयोगशालाओं है कि एक उच्च थ्रूपुट 96 में biofilms का अध्ययन करना चाहते हैं के लिए सिफारिश की है अच्छी तरह से परख कम लागत, बड़ी मात्रा, रासायनिक रूप से टिकाऊ प्लास्टिक सामग्री है कि चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक हैं का उपयोग कर.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए वित्त पोषण कनाडा डिस्कवरी ग्रांट (RGPIN- 2016-05891) के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद से डीसीबी को और कनाडाई जीनोमिक्स रिसर्च एंड डेवलपमेंट इनिशिएटिव ग्रांट (GRDI) कार्यक्रम (GRDI7 2254557) की सरकार से MRM और GRG को अनुदान प्रदान करके प्रदान किया गया था।
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | — | materials for deepwell device sterilization |
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |