يصف البروتوكول الحالي حقن الساركوما العظمية داخل الظنبوب لتوليد نماذج الفئران التي تحمل الساركوما العظمية العظمية وآفات الانبثاث الرئوي.
الساركوما العظمية هي سرطان العظام الأولي الأكثر شيوعا لدى الأطفال والمراهقين، مع الرئتين باعتبارها الموقع النقيلي الأكثر شيوعا. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لمرضى الساركوما العظمية الذين يعانون من ورم خبيث رئوي أقل من 30٪. لذلك ، فإن استخدام نماذج الفئران التي تحاكي تطور الساركوما العظمية في البشر له أهمية كبيرة لفهم الآلية الأساسية لسرطان الساركوما العظمية والانبثاث الرئوي لتطوير علاجات جديدة. هنا ، يتم الإبلاغ عن إجراءات مفصلة لتوليد نماذج الساركوما العظمية الأولية والفئران الخبيثة الرئوية عن طريق الحقن داخل الظنبوب لخلايا الساركوما العظمية. جنبا إلى جنب مع التلألؤ الحيوي أو نظام التصوير الحي بالأشعة السينية ، يتم استخدام نماذج الفئران الحية هذه لمراقبة وقياس نمو الساركوما العظمية والانبثاث. لإنشاء هذا النموذج ، تم تحميل مصفوفة غشاء سفلي تحتوي على خلايا الساركوما العظمية في حقنة صغيرة الحجم وحقنها في ساق واحد من كل فأر أثيميك بعد تخديرها. تم التضحية بالفئران عندما وصلت الساركوما العظمية الأولية إلى الحد الأقصى للحجم في البروتوكول المعتمد من IACUC. تم فصل الساقين اللتين تحملان الساركوما العظمية والرئتين المصابتين بآفات الانبثاث. تتميز هذه النماذج بفترة حضانة قصيرة ، ونمو سريع ، وآفات حادة ، وحساسية في مراقبة تطور الآفات النقيلية الأولية والرئوية. لذلك ، هذه نماذج مثالية لاستكشاف وظائف وآليات عوامل محددة في تسرطن الساركوما العظمية والانبثاث الرئوي ، والبيئة الدقيقة للورم ، وتقييم الفعالية العلاجية في الجسم الحي.
الساركوما العظمية هي سرطان العظام الأولي الأكثر شيوعا لدى الأطفال والمراهقين 1,2 ، والذي يتسلل بشكل رئيسي إلى الأنسجة المحيطة ، وحتى ينتقل إلى الرئتين عند تشخيص المرضى. الانبثاث الرئوي هو التحدي الرئيسي لعلاج الساركوما العظمية ، ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لمرضى الساركوما العظمية الذين يعانون من ورم خبيث رئوي لا يزال منخفضا يصل إلى 20٪ -30٪ 3،4،5. ومع ذلك ، فقد زاد معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات من الساركوما العظمية الأولية إلى حوالي 70 ٪ منذ 1970s بسبب إدخال العلاج الكيميائي6. لذلك ، هناك حاجة ماسة لفهم الآلية الأساسية لسرطان الساركوما العظمية والانبثاث الرئوي لتطوير علاجات جديدة. تطبيق نماذج الفئران التي تحاكي أفضل تطور الساركوما العظمية في البشر له أهمية كبيرة7.
يتم إنشاء النماذج الحيوانية للساركوما العظمية عن طريق الهندسة الوراثية التلقائية المستحثة ، والزرع ، وغيرها من التقنيات. نادرا ما يستخدم نموذج الساركوما العظمية التلقائي بسبب وقت تكوين الورم الطويل ، ومعدل حدوث الورم غير المتناسق ، وانخفاض المراضة ، وضعف الاستقرار 8,9. على الرغم من أن نموذج الساركوما العظمية المستحثة يمكن الحصول عليه أكثر سهولة من الساركوما العظمية التلقائية ، إلا أن تطبيق نموذج الساركوما العظمية المستحثة محدود لأن العامل المحث سيؤثر على البيئة الدقيقة ، والتسبب في الأمراض ، والخصائص المرضية للساركوما العظمية10. تساعد النماذج المعدلة وراثيا على فهم التسبب في السرطانات لأنها يمكن أن تحاكي بشكل أفضل البيئات الفسيولوجية والمرضية البشرية. ومع ذلك ، فإن النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا لها أيضا حدودها بسبب صعوبة التعديل المعدل وراثيا على المدى الطويل والتكلفة العالية. علاوة على ذلك ، حتى في النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا الأكثر قبولا على نطاق واسع الناتجة عن تعديل الجينات p53 و Rb ، حدث 13.6٪ فقط من الساركوما في عظام الأطراف الأربعة11,12.
زرع هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لإنتاج نموذج السرطان النقيلي الأولي والبعيد في السنوات الأخيرة بسبب المناورة البسيطة ، ومعدل تكوين الورم المستقر ، والتجانس الأفضل13. يشمل الزرع زراعة غير متجانسة وزرع العظام وفقا لمواقع الزرع. في زرع الساركوما العظمية غير المتجانسة، يتم حقن خلايا الساركوما العظمية خارج مواقع الساركوما العظمية الأولية (العظام) للحيوانات، عادة تحت الجلد، تحت الجلد14. على الرغم من أن عملية زرع الساركوما غير المتجانسة واضحة دون الحاجة إلى إجراء عملية جراحية في الحيوانات ، إلا أن المواقع التي يتم فيها حقن خلايا الساركوما العظمية لا تمثل البيئة الدقيقة الفعلية للساركوما العظمية البشرية. زرع الساركوما العظمية هو عندما يتم حقن خلايا الساركوما العظمية في عظام الحيوانات، مثل الساق15،16. بالمقارنة مع الطعوم غير المتجانسة ، تتميز الطعوم العظمية العظمية بفترة حضانة قصيرة ، ونمو سريع ، وطبيعة تآكل قوية. لذلك ، فهي نماذج حيوانية مثالية للدراسات المتعلقة بالساركوما العظمية17.
الحيوانات الأكثر استخداما هي الفئران والكلاب وأسماك الزرد18,19. عادة ما يستخدم النموذج التلقائي للساركوما العظمية في الأنياب لأن الساركوما العظمية هي واحدة من أكثر الأورام شيوعا في الأنياب. ومع ذلك ، فإن تطبيق هذا النموذج محدود بسبب وقت تكوين الورم الطويل ، وانخفاض معدل تكوين الورم ، وضعف التجانس ، والاستقرار. غالبا ما تستخدم أسماك الزرد لبناء نماذج الورم المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية بسبب تكاثرها السريع20. لكن جينات الزرد تختلف عن الجينات البشرية ، لذلك فإن تطبيقاتها محدودة.
يصف هذا العمل الإجراءات التفصيلية والاحتياطات والصور التمثيلية لإنتاج الساركوما العظمية الأولية في الساق مع ورم خبيث رئوي عن طريق الحقن داخل الساق لخلايا الساركوما العظمية في الفئران الأثيمية. تم تطبيق هذه الطريقة لإنشاء الساركوما العظمية الأولية في ساق الفئران لتقييم الفعالية العلاجية ، والتي أظهرت قابلية عالية للتكاثر21,22.
الحقن التقويمي لخلايا الساركوما العظمية هو نموذج مثالي لدراسة وظيفة وآلية عوامل محددة في تسرطن الساركوما العظمية وتطويرها لتقييم الفعالية العلاجية. لتجنب الاختلافات في نمو الورم ، يتم حقن معظم خلايا الساركوما العظمية النشطة بنسبة 80٪ -90٪ تلتقي بنفس العدد بعناية في ساق كل فأر ، ويتم التحك?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من (1) البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFC1704300 و 2020YFE0201600) ، (2) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |