הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.
Abstract
הומיאוסטזיס מיטוכונדריאלי redox חשוב עבור הכדאיות העצבית ותפקוד. למרות המיטוכונדריה מכילים מספר מערכות redox, תיול-דיסולפיד חוצץ גלוטתיון נחשב לשחקן מרכזי בהגנות נוגדות חמצון. לכן, מדידת פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי מספק מידע שימושי על מצב תיקון מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני. גלוטרדוקסין1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) הוא אינדיקטור יחסמטרי מבוסס חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המקודד גנטית (GFP) של פוטנציאל הגלוטתיון מחדש בעל שתי פסגות עירור רגישות למצב אדום ב-400 ננומטר ו-490 ננומטר עם שיא פליטה יחיד של 510 ננומטר. מאמר זה מתאר כיצד לבצע מיקרוסקופיה חיה קונפוקלית של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח. הוא מתאר כיצד להעריך גלוטתיון מיטוכונדריאלי במצב יציב מחדש את הפוטנציאל (למשל, להשוות מצבי מחלה או טיפולים ארוכי טווח) וכיצד למדוד שינויים redox על טיפולים חריפים (באמצעות התרופה excitotoxic N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) כדוגמה). בנוסף, המאמר מציג הדמיה משותפת של Grx1-roGFP2 ואת אינדיקטור פוטנציאל המילוכונדריה, tetramethylrhodamine, אתיל אסתר (TMRE), כדי להדגים כיצד Grx1-roGPF2 יכול להיות multiplexed עם אינדיקטורים נוספים עבור ניתוחים multiparametric. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוצלי, (ii) להחיל תרופות לגירוי ואחריו כיול חיישנים עם דימיד ודית’רייטול, ו- (iii) לנתח נתונים עם ImageJ / FIJI.
Introduction
מספר אנזימים מיטוכונדריאליים חשובים ומולקולות איתות כפופים לוויסות תיול redox1. יתר על כן, המיטוכונדריה הם מקור תאי מרכזי של מינים חמצן תגובתי והם פגיעים באופן סלקטיבי לנזק חמצוני2. בהתאם לכך, פוטנציאל ההשמטה המיטוכונדריאלי משפיע ישירות על הביו-אנרגטיקה, איתות התא, תפקוד המיטוכונדריה, ובסופו של דבר על כדאיות התא3,4. המטריצה המיטוכונדריאלית מכילה כמויות גבוהות (1-15 מ”מ) של הגלוטתיון של מאגר התיול-דיסולפיד (GSH) לשמירה על הומיאוסטזיס ולהגנות נוגדות חמצון להרה5,6. GSH יכול להיות מחובר covalenting חלבונים היעד (S-גלוטתיוניליציה) כדי לשלוט במצבם מחדש ופעילותם והוא משמש על ידי מגוון של אנזימים detoxifying להפחית חלבונים מחומצנים. לכן, פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון המיטוכונדריאלי הוא פרמטר אינפורמטיבי מאוד בעת לימוד תפקוד מיטוכונדריאלי ופתופיזיולוגיה.
roGFP2 היא גרסה של GFP שנעשתה רגישה ל-redox על ידי תוספת של שני צייסטנים חשופים פני השטח היוצרים זוג dithiol-disulfide מלאכותי7,8. יש לו שיא פליטה יחיד ב ~ 510 ננומטר ושתי פסגות עירור ב ~ 400 ננומטר ו 490 ננומטר. חשוב לציין, המשרעת היחסית של שתי פסגות העירור תלויות במצב ההוקסר מחדש של roGFP2 (איור 1), מה שהופך את החלבון הזה לחיישן רצימטרי. בחיישן Grx1-roGFP2, גלוטרוקסין-1 אנושי הותך לטרמינל N של roGFP29,10. התקשרות קוולנטית של האנזים Grx1 ל- roGFP2 מעניקה שני שיפורים עיקריים של החיישן: היא הופכת את תגובת החיישן לספציפית עבור זוג הגלוטתיון GSH/GSSG (איור 1), והוא מאיץ את השיוויון בין GSSG ל- roGFP2 בגורם של לפחות 100,0009. לכן, Grx1-roGFP2 מאפשר הדמיה ספציפית ודינמית של פוטנציאל הגלוטתיון התאי מחדש.
הדמיית Grx1-roGFP2 יכולה להתבצע במגוון רחב של מיקרוסקופים, כולל מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רחבים, מיקרוסקופים קונפוקליים מסתובבים של דיסקים ומיקרוסקופים קונפוקליים לסריקת לייזר. ביטוי החיישן בתאי העצב העיקריים יכול להתבצע בשיטות שונות הכוללות ליפופקטיון11, COPRECIPitation DNA/סידן-פוספט12, העברת גנים בתיווך וירוסים או שימוש בבעלי חיים מהונדסים כמקור התא (איור 2). וירוסים רקומביננטיים מדומים (rAAV) המכילים יחס של 1:1 של חלבונים קבסידיים AAV1 ו- AAV2 13,14 שימשו לניסויים במאמר זה. עם וקטור זה, ביטוי חיישן מקסימלי הוא הגיע בדרך כלל 4-5 ימים לאחר ההדבקה ונשאר יציב לפחות שבועיים. השתמשנו בהצלחה Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח מעכברים וחולדות.
במאמר זה, ביטוי בתיווך rAAV של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפול חולדה ראשוני נוירונים קליפת המוח משמש להערכת מצב גלוטתיון מיטוכונדריאלי בזאלי ואת ההפרעה החריפה שלה. פרוטוקול מסופק עבור הדמיה חיה confocal עם הוראות מפורטות כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ קונפוקליות סריקת לייזר, (ii) להפעיל ניסוי הדמיה חיה, ו -(iii) לנתח נתונים עם FIJI.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידות כמותיות ודינמיות של מצב ההוקסיד המיטוכונדריאלי מספקות מידע חשוב על פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית ופיזיולוגיה תאית. מספר בדיקות כימיות פלואורוגניות זמינות המזהות מינים של חמצן תגובתי, “לחץ אדום”, או “עקה חמצונית”. עם זאת, המונחים האחרונים אינם מוגדרים היטב ולעתים קרובות חסרים ספציפיות9…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (BA 3679/5-1; עבור 2289: BA 3679/4-2). A.K. נתמך על ידי מלגת ERASMUS + . אנו מודים לאיריס בנזלי-ארט, ריטה רוזנר ואנדראה שליקסופ על הכנת תאי העצב העיקריים. אנו מודים לד”ר טוביאס דיק על שסיפק pLPCX-מיטו-Grx1-roGFP2. ניסויים שהוצגו באיור 4 בוצעו במרכז הדמיה ניקון, אוניברסיטת היידלברג. איור 2 הוכן עם BioRender.com.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
- Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
- Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
- Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
- Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
- Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
- Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
- Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
- Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
- Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).
