Her præsenterer vi en protokol til vurdering af de neurobeskyttende aktiviteter af testforbindelser i Caenorhabditis elegans, herunder polyglutaminaggregering, neuronal død og kemooavoidanceadfærd samt en eksemplarisk integration af flere fænotyper.
Aldersrelateret misfoldning og aggregering af patogene proteiner er ansvarlige for flere neurodegenerative sygdomme. For eksempel er Huntingtons Sygdom (HS) hovedsageligt drevet af en CAG-nukleotid-gentagelse, der koder for en udvidet glutaminkanal i huntingtinprotein. Inhiberingen af polyglutamin (polyQ) aggregering og især aggregeringsassocieret neurotoksicitet er således en nyttig strategi til forebyggelse af HS og andre polyQ-associerede tilstande. Dette papir introducerer generaliserede eksperimentelle protokoller til vurdering af testforbindelsers neuroprotektive kapacitet mod HS ved hjælp af etablerede polyQ transgene Caenorhabditis elegans modeller. AM141-stammen vælges til polyQ-aggregeringsassayet, da en aldersassocieret fænotype af diskrete fluorescerende aggregater let kan observeres i dens kropsvæg på voksenstadiet på grund af muskelspecifik ekspression af polyQ: : YFP-fusionsproteiner. I modsætning hertil bruges HA759-modellen med stærkt udtryk for polyQ-udvidede kanaler i ASH-neuroner til at undersøge neuronal død og kemooavoidanceadfærd. For omfattende at evaluere målforbindelsernes neuroprotektive kapacitet præsenteres ovenstående testresultater i sidste ende som et radardiagram med profilering af flere fænotyper på en måde med direkte sammenligning og direkte visning.
Progressiv neurodegeneration i HS involverer patogen mutant huntingtin med en unormal strækning af polyQ kodet af CAG trinukleotid gentager 1,2,3. Mutante huntingtinproteiner med mere end 37 glutamin-gentagelser er tilbøjelige til at samle sig og ophobes i hjernen hos HS-patienter og dyremodeller 4,5, hvilket i sidste ende fører til neurodegeneration6. På trods af den manglende klarhed om polyQ-aggregaternes rolle i sygdomspatologi5 er inhiberingen af polyQ-aggregering og dens tilknyttede toksicitet en nyttig terapeutisk strategi for HS og andre polyQ-sygdomme 4,7,8.
På grund af bevarelsen i neuronale signalveje og let at konstruere transgene sygdomsmodeller er Caenorhabditis elegans blevet anvendt i vid udstrækning som en vigtig modelorganisme til undersøgelse af neurologiske lidelser 9,10,11,12. For eksempel kan transgene C. elegans-modeller, der udtrykker aggregeringsudsatte polyQ-udvidelser, objektivt efterligne HS-lignende funktioner såsom selektivt neuronalt celletab, cytoplasmisk aggregatdannelse og adfærdsdefekter13. Undersøgelse af de potentielle virkninger af testprøver for at vende disse fænotyper i etablerede polyQ nematodemodeller har ført til identifikation af en række lovende terapeutiske kandidater, fx polysaccharider 7,14,15, oligosaccharider16, naturlige små molekyler17,18 og urteekstrakter og formler19,20.
Beskrevet her er to hoved polyQ C. elegans modeller og relevante protokoller for potentielle anvendelser som eksemplificeret ved undersøgelsen af astragalan, et polysaccharid isoleret fra Astragalus membranaceus7. Til polyQ-aggregeringsassayet i C. elegans er den anvendte model den transgene stamme AM141, som viser fluorescerende puncta spredt i sin kropsvægsmuskel, når den når voksenalderen på grund af ekspressionen af Q40::YFP-fusionsproteinet, en polyQ-kanal med 40 rester (polyQ40) smeltet sammen til gult fluorescerende protein (YFP)21,22 . Stammen HA759 blev brugt til at undersøge neuronal overlevelse og kemooavoidance adfærd, da den udtrykker både grønt fluorescerende protein (GFP) og Htn-Q150 (en human huntingtin-afledt polyQ-kanal med 150 rester) stærkt i ASH neuroner, men svagt i andre neuroner, hvilket resulterer i progressiv neurodegeneration og ASH-celledød 7,13. Et omfattende resumé af terapeutiske kandidaters neuroprotektive potentiale tilvejebringes ved at integrere resultater fra forskellige assays.
Da polyQ-aggregering og proteotoksicitet er vigtige træk ved polyQ-lidelser, såsom Huntingtons Sygdom13, anbefaler vi brugen af flere modeller og metoder til omfattende evaluering af testforbindelsernes neurobeskyttende kapacitet, herunder polyQ-aggregeringsassayet i AM141-stammen, ASH neuronal overlevelsesassay i HA759-stammen og det kemosensoriske undgåelsesassay i HA759-stammen. De protokoller, der præsenteres her, er blevet brugt til at evaluere testprøvernes neuroprotektive kapacitet mod polyQ-toksicitet, herunder hæmmende virkninger på både polyQ-aggregering og tilhørende neurotoksicitet 7,14,15,16,17,19,20, hvilket viser deres potentiale i lægemiddelopdagelse for HS og andre polyQ-sygdomme.
Et automatiseret billeddannelses- og analysesystem introduceres til påvisning og tælling af polyQ-aggregater i polyQ-aggregeringsassayet. Denne metode har fordelene ved at være højgennemstrømning og tidseffektiv og resulterer i signifikant reducerede subjektive fejl i den besværlige tælleproces. For en hel plade med 384 brønde tager det kun <1 time at afslutte billedoptagelse og analyse. Den konventionelle mikroskopiske billeddannelsesmetode har imidlertid også vist lignende ydeevne i dette laboratorium uden brug af den automatiserede billeddannelsesenhed7.
I alt 100-150 nematoder pr. behandling anbefales i et typisk Q40::YFP-aggregeringsassay for hvert tidspunkt, som kan udføres i replikatbrønde indeholdende 10-15 nematoder hver. Det skal dog bemærkes, at L1 larver kan være mere følsomme over for nogle behandlinger eller højere koncentrationer. Derfor kan højere doser af testforbindelser hæmme deres vækst, hvilket fører til falsk-positive resultater på grund af langsom vækst og dermed forsinket polyQ-aggregering. Normalt kan der udføres et fødevareclearanceassay for at løse dette problem og sikre det passende koncentrationsområde for testforbindelser23.
HA759 transgene nematoder, der anvendes i polyQ neurotoksicitetsassays, udtrykker OSM-10::GFP og Htn-Q150, hvilket gør det muligt entydigt at identificere bilaterale ASH sensoriske neuroner. Derfor evalueres ASH-neuronoverlevelse ved tilstedeværelsen eller fraværet af GFP-ekspression; normalt er ~ 40-75% af ASH neuroner i kontrol nematoderne døde23,24. Interessant nok er pqe-1 (polyglutaminforstærker-1) genetisk mutant baggrund i HA759-stammen (pqe-1; Htn-Q150) accelererer polyQ-medieret toksicitet, hvilket fører til døden af de fleste ASH-neuroner inden for tre dage, selv ved 15 ° C, og derfor dyrkes denne stamme ved 15 ° C for neuronal overlevelsesassay, som tidligere rapporteret23,24.
Funktionelt tab af ASH-neuroner i HA759-nematoder kan forekomme før påvisning af celledød og proteinaggregater13; derfor er det osmotiske undgåelsesadfærdsassay afgørende for vurderingen af polyQ-medieret toksicitet. For at minimere den potentielle indvirkning af mindre aktive HA759-nematoder ved lav temperatur på adfærdsmæssige eksperimenter inkuberes undgåelsesassaypladerne i en befugtet 23 ° C inkubator snarere end ved 15 ° C som i neuronal overlevelsesassay ved hjælp af denne stamme. Derudover er det blevet rapporteret, at Htn-Q150 / OSM-10: : GFP transgene nematoder er meget følsomme over for næseberøring; derfor er en alternativ påvisning af ASH-neuronfunktion næseberøringsassay13.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker tidligere medlemmer af Huang Lab, der har hjulpet med at udvikle og forbedre de protokoller, der anvendes i dette papir, især Hanrui Zhang, Lingyun Xiao og Yanxia Xiang. Dette arbejde blev støttet af 111-projektet (bevillingsnummer B17018) og Natural Science Foundation of Hebei Province (tilskudsnummer H2020207002).
C. elegans strains | |||
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
E. coli strains | |||
NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
Reagent | |||
Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
Equipment | |||
384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress Pico | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
Software | |||
Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |