यहां, हम पॉलीग्लूटामाइन एकत्रीकरण, न्यूरोनल मृत्यु और केमोएवॉयडेंस व्यवहार के साथ-साथ कई फेनोटाइप्स के अनुकरणीय एकीकरण सहित कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में परीक्षण यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधियों का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
रोगजनक प्रोटीन की उम्र से संबंधित मिसफोल्डिंग और एकत्रीकरण कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए जिम्मेदार हैं। उदाहरण के लिए, हंटिंगटन रोग (एचडी) मुख्य रूप से एक सीएजी न्यूक्लियोटाइड रिपीट द्वारा संचालित होता है जो हंटिंगटिन प्रोटीन में एक विस्तारित ग्लूटामाइन पथ को एन्कोड करता है। इस प्रकार, पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) एकत्रीकरण का निषेध और, विशेष रूप से, एकत्रीकरण से जुड़े न्यूरोटॉक्सिसिटी एचडी और अन्य पॉलीक्यू से जुड़ी स्थितियों की रोकथाम के लिए एक उपयोगी रणनीति है। यह पेपर स्थापित पॉलीक्यू ट्रांसजेनिक कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस मॉडल का उपयोग करके एचडी के खिलाफ परीक्षण यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का आकलन करने के लिए सामान्यीकृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का परिचय देता है। एएम 141 तनाव को पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख के लिए चुना जाता है क्योंकि असतत फ्लोरोसेंट समुच्चय के आयु से जुड़े फेनोटाइप को पॉलीक्यू की मांसपेशियों की विशिष्ट अभिव्यक्ति के कारण वयस्क चरण में अपने शरीर की दीवार में आसानी से देखा जा सकता है:: वाईएफपी संलयन प्रोटीन। इसके विपरीत, एएसएच न्यूरॉन्स में पॉलीक्यू-विस्तारित ट्रैक्ट्स की मजबूत अभिव्यक्ति के साथ एचए 759 मॉडल का उपयोग न्यूरोनल मृत्यु और केमोएवॉइडेंस व्यवहार की जांच करने के लिए किया जाता है। लक्ष्य यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने के लिए, उपरोक्त परीक्षण परिणाम अंततः प्रत्यक्ष तुलना और प्रत्यक्ष देखने के तरीके से कई फेनोटाइप की प्रोफाइलिंग के साथ एक रडार चार्ट के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं।
एचडी में प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेशन में सीएजी ट्राइन्यूक्लियोटाइड द्वारा एन्कोडेड पॉलीक्यू के असामान्य खिंचाव के साथ रोगजनक उत्परिवर्ती हंटिंगटिन शामिल है। 37 से अधिक ग्लूटामाइन दोहराव वाले उत्परिवर्ती हंटिंगटिन प्रोटीन एचडी रोगियों और पशु मॉडल 4,5 के दिमाग में एकत्रित और जमा होने के लिए प्रवण होते हैं, जो अंततः न्यूरोडीजेनेरेशन6 की ओर जाता है। रोग विकृति 5 में पॉलीक्यू समुच्चय की भूमिकाओं पर स्पष्टता की कमी के बावजूद, पॉलीक्यू एकत्रीकरण औरइससे संबंधित विषाक्तता का निषेध एचडी और अन्य पॉलीक्यू रोगों 4,7,8 के लिए एक उपयोगी चिकित्सीय रणनीति है।
न्यूरोनल सिग्नलिंग मार्गों और आसानी से निर्माण करने वाले ट्रांसजेनिक रोग मॉडल में संरक्षण के कारण, केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस का व्यापक रूप से न्यूरोलॉजिकल विकारों 9,10,11,12 की जांच के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, एकत्रीकरण-प्रवण पॉलीक्यू विस्तार व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस मॉडल निष्पक्ष रूप से एचडी जैसी विशेषताओं की नकल कर सकते हैं जैसे चयनात्मक न्यूरोनल सेल हानि, साइटोप्लाज्मिक कुल गठन और व्यवहार दोष13. स्थापित पॉलीक्यू नेमाटोड मॉडल में इन फेनोटाइप्स को उलटने के लिए परीक्षण नमूनों के संभावित प्रभावों की जांच ने विभिन्न प्रकार के होनहार चिकित्सीय उम्मीदवारों की पहचान की है, उदाहरण के लिए, पॉलीसेकेराइड 7,14,15, ओलिगोसेकेराइड16, प्राकृतिक छोटे अणु17,18, और हर्बल अर्क और सूत्र19,20।
एलिगेंस मॉडल और संभावित अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक प्रोटोकॉल हैं, जैसा कि एस्ट्रागलन पर अध्ययन द्वारा उदाहरण दिया गया है, एस्ट्रागलस मेम्ब्रानेसियस7 से पृथक एक पॉलीसेकेराइड। सी एलिगेंस में पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख के लिए, इस्तेमाल किया गया मॉडल ट्रांसजेनिक तनाव एएम 141 है, जो क्यू 40 की अभिव्यक्ति के कारण वयस्कता तक पहुंचने पर अपने शरीर की दीवार की मांसपेशियों में फ्लोरोसेंट पंक्टा को दिखाता है: : वाईएफपी संलयन प्रोटीन, 40 अवशेषों का एक पॉलीक्यू पथ (पॉलीक्यू 40) पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) 21,22 से जुड़ा हुआ है . तनाव एचए 75 9 का उपयोग न्यूरोनल अस्तित्व और कीमोएवॉइडेंस व्यवहार की जांच करने के लिए किया गया था क्योंकि यह एएसएच न्यूरॉन्स में दृढ़ता से हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और एचटीएन-क्यू 150 (150 अवशेषों का एक मानव हंटिंगटिन-व्युत्पन्न पॉलीक्यू ट्रैक्ट) दोनों को व्यक्त करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेशन और एएसएच कोशिका मृत्यु 7,13 होती है। चिकित्सीय उम्मीदवारों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का एक व्यापक सारांश विभिन्न परखों से परिणामों को एकीकृत करके प्रदान किया जाता है।
चूंकि पॉलीक्यू एकत्रीकरण और प्रोटियोटॉक्सिसिटी पॉलीक्यू विकारों की महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं, जैसे हंटिंगटन रोग13, हम परीक्षण यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का व्यापक मूल्यांकन करने के लिए कई मॉडलों और विधियों के उपयोग की सलाह देते हैं, जिसमें एएम 141 तनाव में पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख, एचए 75 9 तनाव में एएसएच न्यूरोनल उत्तरजीविता परख, और एचए 75 9 तनाव में कीमोसेंसरी परिहार परख शामिल है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग पॉलीक्यू विषाक्तता के खिलाफ परीक्षण नमूनों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है, जिसमें पॉलीक्यू एकत्रीकरण और संबंधित न्यूरोटॉक्सिसिटी 7,14,15,16,17,19,20 दोनों पर निरोधात्मक प्रभाव शामिल हैं, जो एचडी और अन्य पॉलीक्यू रोगों के लिए दवा की खोज में उनकी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं।
पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख में पॉलीक्यू समुच्चय का पता लगाने और गिनती के लिए एक स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली पेश की जाती है। इस पद्धति में उच्च-थ्रूपुट और समय-कुशल होने के फायदे हैं और इसके परिणामस्वरूप श्रमसाध्य गिनती प्रक्रिया में व्यक्तिपरक त्रुटियां काफी कम हो जाती हैं। एक पूरे 384-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण को पूरा करने में केवल <1 घंटे लगते हैं। हालांकि, पारंपरिक सूक्ष्म इमेजिंग विधि ने स्वचालित इमेजिंग डिवाइस7 का उपयोग किए बिना इस प्रयोगशाला में समान प्रदर्शन भी दिखाया है।
उपचार प्रति कुल 100-150 नेमाटोड प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक विशिष्ट क्यू 40:: वाईएफपी एकत्रीकरण परख में अनुशंसित हैं, जो प्रत्येक 10-15 नेमाटोड युक्त प्रतिकृति कुओं में किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एल 1 लार्वा कुछ उपचारों या उच्च सांद्रता के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकता है। इसलिए, परीक्षण यौगिकों की उच्च खुराक उनके विकास को बाधित कर सकती है, जिससे धीमी वृद्धि के कारण झूठे-सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं और इस प्रकार, पॉलीक्यू एकत्रीकरण में देरी हो सकती है। आमतौर पर, इस चिंता को दूर करने और परीक्षण यौगिकों की उचित एकाग्रता सीमा सुनिश्चित करने के लिए एक खाद्य निकासी परख किया जा सकताहै 23.
पॉलीक्यू न्यूरोटॉक्सिसिटी परख में उपयोग किए जाने वाले एचए 75 9 ट्रांसजेनिक नेमाटोड ओएसएम -10 :: जीएफपी और एचटीएन-क्यू 150 को कोएक्सप्रेस करते हैं, जिससे द्विपक्षीय एएसएच संवेदी न्यूरॉन्स की स्पष्ट रूप से पहचान करना संभव हो जाता है। इसलिए, एएसएच न्यूरॉन अस्तित्व का मूल्यांकन जीएफपी अभिव्यक्ति की उपस्थिति या अनुपस्थिति से किया जाता है; आमतौर पर, नियंत्रण सूत्रकृमि में एएसएच न्यूरॉन्स का ~ 40-75%23,24 मृत हो जाता है। दिलचस्प बात यह है कि एचए 759 तनाव (पीक्यूई -1) में पीक्यूई -1 (पॉलीग्लूटामाइन एन्हांसर -1) आनुवंशिक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि; एचटीएन-क्यू 150) पॉलीक्यू-मध्यस्थता विषाक्तता को तेज करता है, जिससे तीन दिनों के भीतर अधिकांश एएसएच न्यूरॉन्स की मृत्यु हो जाती है, यहां तक कि 15 डिग्री सेल्सियस पर भी, और इसलिए यह तनाव न्यूरोनल उत्तरजीविता परख के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है, जैसा कि पहले23,24 की सूचना दी गई थी।
एचए 759 नेमाटोड में एएसएच न्यूरॉन्स का कार्यात्मक नुकसान कोशिका मृत्यु और प्रोटीन समुच्चय13 का पता लगाने से पहले हो सकता है; इसलिए, आसमाटिक परिहार व्यवहार परख पॉलीक्यू-मध्यस्थता विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है। व्यवहार प्रयोगों पर कम तापमान पर कम सक्रिय एचए 759 नेमाटोड के संभावित प्रभाव को कम करने के लिए, परिहार परख प्लेटों को इस तनाव का उपयोग करके न्यूरोनल उत्तरजीविता परख के रूप में 15 डिग्री सेल्सियस के बजाय आर्द्र 23 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊष्मायन किया जाता है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि एचटीएन-क्यू 150 / ओएसएम -10:: जीएफपी ट्रांसजेनिक नेमाटोड नाक स्पर्श के प्रति अत्यधिक संवेदनशील हैं; इसलिए, एएसएच न्यूरॉन फ़ंक्शन का एक वैकल्पिक पता लगाना नाक स्पर्श परख13 है।
The authors have nothing to disclose.
हम हुआंग लैब के पूर्व सदस्यों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस पत्र में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को विकसित करने और सुधारने में मदद की है, विशेष रूप से, हनरुई झांग, लिंगयुन जिओ और यांक्सिया जियांग। इस काम को 111 परियोजना (अनुदान संख्या बी 17018) और हेबेई प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या एच 2020207002) द्वारा समर्थित किया गया था।
C. elegans strains | |||
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
E. coli strains | |||
NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
Reagent | |||
Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
Equipment | |||
384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress Pico | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
Software | |||
Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |