Uracil-डीएनए Glycosylase मैट्रिक्स द्वारा परख-सहायता प्राप्त लेजर Desorption / Ionization समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
Summary
एक गैर लेबल, गैर-रेडियो-आइसोटोपिक विधि परख uracil-डीएनए ग्लाइकोसिलेस गतिविधि प्रत्यक्ष apurinic / apyrimidinic साइट युक्त उत्पाद विश्लेषण के लिए MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर विकसित किया गया था। परख काफी सरल, विशिष्ट, तेजी से, और डीएनए ग्लाइकोसिलेज माप के लिए उपयोग करने में आसान साबित हुआ।
Abstract
यूरेसिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेज (यूडीजी) साइटोसिन के हाइड्रोलाइटिक डिमिनेशन से गठित यूरेसिल के सुधार के लिए आधार उच्छेदन मरम्मत मार्ग में एक महत्वपूर्ण घटक है। इस प्रकार, यह जीनोम अखंडता रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। यूडीजी गतिविधि को मापने के लिए एक अत्यधिक विशिष्ट, गैर-लेबल, गैर-रेडियो-आइसोटोपिक विधि विकसित की गई थी। एक सिंथेटिक डीएनए डुप्लेक्स जिसमें एक साइट-विशिष्ट यूरेसिल होता है, को यूडीजी द्वारा क्लीव किया गया था और फिर मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर विशोषण / आयनीकरण टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF MS) विश्लेषण के अधीन किया गया था। स्ट्रैंड ब्रेक के बिना डीएनए में apurinic / apyrimidinic साइट (AP) उत्पाद को संरक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया गया था। सब्सट्रेट से उत्पाद में एम / जेड मान में परिवर्तन का उपयोग यूडीजी द्वारा यूरेसिल हाइड्रोलिसिस का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एक G: U सब्सट्रेट का उपयोग UDG गतिज विश्लेषण के लिए किया गया था, जो Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM / s, और Kcat = 9.31 s-1 को उत्पन्न करता है। एक uracil ग्लाइकोसिलेज अवरोधक (UGI) परख के लिए इस विधि के आवेदन 7.6 पीएम के एक IC50 मूल्य उपज. एकल-फंसे हुए और डबल-फंसे डीएनए सब्सट्रेट के भीतर विभिन्न पदों पर यूरेसिल का उपयोग करके यूडीजी विशिष्टता ने विभिन्न दरार क्षमताओं का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, यह सरल, तेजी से, और बहुमुखी MALDI-TOF एमएस विधि विभिन्न monofunctional डीएनए ग्लाइकोसिलेस के लिए एक उत्कृष्ट संदर्भ विधि हो सकती है। इसमें डीएनए ग्लाइकोसिलेज इनहिबिटर स्क्रीनिंग के लिए एक उपकरण के रूप में क्षमता भी है।
Introduction
यद्यपि यूरेसिल आरएनए में एक सामान्य आधार है, यह जीनोमिक डीएनए में एक सामान्य और अत्यधिक म्यूटाजेनिक घाव है। यूरेसिल एक डीऑक्सीसाइटिडीन के सहज / एंजाइमेटिक हाइड्रोलाइटिक डिमिनेशन से उत्पन्न हो सकता है। प्रत्येक जीवित कोशिका में, यह deamination शारीरिक परिस्थितियों में प्रति दिन 100-500 बार होता है1,2। यदि इन परिवर्तनों की मरम्मत नहीं की जाती है, तो डीएनए अनुक्रम संरचना में परिवर्तन हो सकता है, जिससे उत्परिवर्तन हो सकता है। जैसा कि डीएनए में यूरेसिल प्रतिकृति के दौरान डीएटीपी के साथ जोड़ी बनाना पसंद करता है, यदि साइटोसिन यूरेसिल को डीमिनेट करता है, तो दो प्रतिकृति घटनाओं में, संतान डीएनए 3 के आधे हिस्से में एक नया जी: सी से ए: टी संक्रमण उत्परिवर्तन होगा।
आनुवांशिक स्थिरता को बनाए रखने के लिए सेलुलर रणनीतियों में से, बेस उच्छेदन मरम्मत (बीईआर) एक आवश्यक तंत्र है जो डीएनए 4 में यूरेसिल जैसे क्षतिग्रस्त ठिकानों की मरम्मत करता है। बीईआर एक अत्यधिक विकासवादी रूप से संरक्षित प्रक्रिया है। दो सामान्य बीईआर मार्ग हैं: शॉर्ट-पैच मार्ग जो एकल न्यूक्लियोटाइड की मरम्मत पथ की ओर जाता है और लंबे पैच मार्ग जो कम से कम दो न्यूक्लियोटाइड्स 5 की मरम्मत पथ का उत्पादन करता है। बीईआर एक समन्वित तंत्र है जो कई चरणों में होता है। बीईआर में पहला कदम क्षतिग्रस्त न्यूक्लियोटाइड बेस का एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस है जो एक क्षति-विशिष्ट डीएनए ग्लाइकोसिलेज द्वारा एक एपुरीनिक / एपिरिमिडिनिक (एपी) मध्यवर्ती साइट 6 उत्पन्न करने के लिए है। इसके बाद एक एंडोन्यूक्लिएज द्वारा एपी साइट पर चीनी-फॉस्फेट बैकबोन की दरार, डीएनए की सफाई एक लाइस द्वारा समाप्त होती है, डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा गैप-फिलिंग, और एक लिगाज़ 5 द्वारा अंतिम निक को सील करना।
यूरेसिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेज (यूडीजी) एस्चेरिचिया कोलाई में बीईआर के लिए यूरेसिल युक्त डीएनए से यूरेसिल को हाइड्रोलाइज करता है। रेडियोलेबल डीएनए का उपयोग करके पारंपरिक UDG assays जिसमें विभिन्न पृथक्करण तकनीकें शामिल हैं6,7,8,9,10,11,12,13 आमतौर पर समय लेने वाली, श्रम-गहन, महंगी लेबलिंग अभिकर्मकों, जटिल प्रक्रियाओं के साथ, और रेडियोधर्मी सामग्रियों के संपर्क के जोखिम को कम करने के लिए गहन प्रशिक्षण और अभ्यास की आवश्यकता होती है। फ्लोरोमेट्रिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड एसेस को रेडियोआइसोटोप लेबलिंग 14 के प्रतिस्थापन के रूप में विकसित किया गया है, इसके अलावा आणविक बीकन और फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण प्रौद्योगिकी 15,16,17,18,19,20। हालांकि, सभी उपर्युक्त विधियों के लिए विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता होती है। हाल ही में लेबल मुक्त बायोसेंसर assays21,22,23 और एक जी-quadruplex24,25,26 के गठन के आधार पर colorimetric तरीकों को विकसित किया गया है। हालांकि, कई ए: यू जोड़े या विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए अनुक्रमों में जांच एंजाइम इकाई परिभाषा को जटिल बनाती है।
MALDI-TOF MS एक ऐसी तकनीक है जो डीएनए विश्लेषण में बहुत उपयोगी हो सकती है। विकसित अनुप्रयोगों में एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता जीनोटाइपिंग 27,28, संशोधित न्यूक्लियोटाइड विश्लेषण 29, और डीएनए मरम्मत मध्यवर्ती पहचान 30,31,32,33,34 शामिल हैं। MALDI-TOF MS को AP-साइट-युक्त डीएनए उत्पादों का पता लगाने के लिए डीएनए ग्लाइकोसिलेज विश्लेषण के लिए आसानी से अपनाया जाना चाहिए। हालांकि, डीएनए में एपी-साइटें कई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत स्ट्रैंड ब्रेक के लिए प्रवण हैं33। एक UDG परख यहाँ MALDI-TOF एमएस का उपयोग कर सीधे महत्वपूर्ण स्ट्रैंड तोड़ने शोर के बिना एपी साइट उत्पादन को मापने के लिए प्रस्तुत किया जाता है. इस लेबल-मुक्त विधि के साथ काम करना आसान है और इसमें डीएनए ग्लाइकोसिलेज इनहिबिटर स्क्रीनिंग के फार्मास्यूटिकल अनुप्रयोग के लिए एक उच्च क्षमता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर सीधे एपी युक्त डीएनए उत्पादों का पता लगाने के लिए एक UDG MALDI-TOF एमएस परख विधि का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है। इस विधि के मुख्य लाभ यह हैं कि यूरेसिल युक्त सब्सट्रेट लेबल-मुक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कार्यात्मक जीनोमिक्स (ताइपे, ताइवान) और एनआरपीबी फार्माकोजेनोमिक्स लैब (ताइपे, ताइवान) के लिए एनसीएफपीबी एकीकृत कोर सुविधा को उनके तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान, आर.ओ.C द्वारा समर्थित किया गया था[ अनुदान संख्या MOST109-2314-B-002 -186 K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 से S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 से W.-h.F.] एच.-एल.C नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय से डॉक्टरेट फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है। ओपन एक्सेस चार्ज के लिए फंडिंग: विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, आर.ओ.C।
Materials
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
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