Collecte, expansion et différenciation de modèles de cellules épithéliales nasales nasales humaines primaires pour la quantification de la fréquence des battements de cils
Summary
Ce protocole décrit la collecte, l’expansion et la différenciation des cellules épithéliales nasales en modèles organotypiques de cellules épithéliales des voies respiratoires et la quantification de la fréquence des battements de cils via l’imagerie de cellules vivantes et des scripts personnalisés.
Abstract
Les mesures de la fonction des cils (fréquence des battements, modèle) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive. Cependant, l’application plus large de ces techniques est limitée par l’extrême susceptibilité de la fonction ciliaire aux changements de facteurs environnementaux, par exemple la température, l’humidité et le pH. Dans les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose (FK), l’accumulation de mucus empêche les cils battants. La fonction des cils a été étudiée dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité du canal CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) de la FC. Cependant, une variabilité considérable d’un patient à l’autre dans la fréquence des battements de cils a été observée en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR, même pour les patients présentant les mêmes mutations CFTR . De plus, l’impact de la sécrétion de chlorure régulée par le CFTR sur la fonction ciliaire est mal compris. Il n’existe actuellement aucun protocole complet démontrant la préparation d’échantillons de modèles de voies respiratoires in vitro , l’acquisition d’images et l’analyse de la fréquence de battement des cils (CBF). Des conditions de culture normalisées et l’acquisition d’images effectuées dans des conditions environnementales contrôlées permettraient une quantification cohérente et reproductible du FBC entre les individus et en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR. Ce protocole décrit la quantification du CBF dans trois systèmes différents de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires : 1) les feuilles épithéliales natives, 2) les modèles d’interface air-liquide imagés sur des inserts de support perméables et 3) les organoïdes tridimensionnels intégrés dans la matrice extracellulaire. Les deux derniers reproduisent la physiologie pulmonaire in vivo , avec des cils battants et la production de mucus. La fonction ciliaire est capturée à l’aide d’une caméra vidéo haute vitesse dans une chambre contrôlée par l’environnement. Des scripts personnalisés sont utilisés pour l’analyse des CBF. L’application des mesures de la FBC à la clinique est envisagée comme un outil clinique important pour prédire la réponse aux médicaments modulateurs du CFTR par patient.
Introduction
Les mesures de la fréquence et du profil des battements des cils (CBF) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive (DCP)1. Dans la mucoviscidose (FK), le dysfonctionnement du canal chlorure du régulateur de conductance transmembranaire (CFTR) de la mucoviscidose provoque une déshydratation du liquide de surface des voies respiratoires et une altération de la clairance mucociliaire2. La fonction ciliaire a été étudiée in vitro dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité des canaux CFTR3. Cependant, il existe une variabilité considérable d’un patient à l’autre dans la FBC en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR, même pour les patients présentant les mêmes mutations CFTR 3. De plus, l’impact de la sécrétion de chlorure régulée par le CFTR sur la fonction ciliaire est mal compris. Il n’existe actuellement aucun protocole complet démontrant la préparation d’échantillons de modèles in vitro des voies respiratoires, l’acquisition d’images et l’analyse du CBF.
Les feuilles épithéliales nasales isolées des brossages de la muqueuse nasale sont directement utilisées pour les mesures de la fonction ciliaire pour le diagnostic de la DCP4. Pourtant, bien qu’il n’y ait aucun contrôle sur la taille ou la qualité des feuillets épithéliaux nasaux obtenus, le FBC varie selon qu’il est mesuré sur des cellules individuelles ou des feuillets cellulaires et sur des bords ciliés de la feuille épithéliale qui sont perturbés ou nonperturbés 5. En tant que telles, les dyskinésies secondaires causées par des dommages aux cellules lors du prélèvement des brossages de la muqueuse nasale peuvent influencer le CBF. La culture cellulaire primaire de cellules épithéliales nasales et leur différenciation à l’interface air-liquide (ALI) ou dans la matrice tridimensionnelle de la membrane basale en organoïdes épithéliaux ciliés des voies respiratoires donnent naissance à des cils exempts de dyskinésies secondaires 4,6,7,8. Les cellules épithéliales des voies respiratoires différenciées à l’ALI (ci-après appelées modèles ALI) ont été considérées comme une aide diagnostique secondaire importante qui reproduit les modèles de battements ciliaires et la fréquence des brossages ex vivo de la muqueuse nasale6 et permet l’analyse de l’ultrastructure ciliaire, du diagramme des battements et de la fréquence des battements tout en conservant les défauts spécifiques au patient9 . Pourtant, des divergences existent dans les méthodologies utilisées pour créer ces modèles cellulaires différenciés mucociliaires pseudostratifiés. Différents protocoles d’expansion ou de différenciation de la culture pourraient induire des phénotypes épithéliaux distincts (ciliés ou sécrétoires)10 et entraîner des différences significatives dans le CBF11. Le FBC a été quantifié dans les brossages épithéliaux nasaux 4,6,12,13,14,15,16, les organoïdes épithéliaux des voies respiratoires 14,17,18 et les modèles ALI 3,4,6,13,19,20, 21. Pourtant, parmi ces protocoles, il existe de grandes variabilités, et souvent de nombreux paramètres ne sont pas contrôlés. Par exemple, dans certaines études, le CBF est imagé in situ alors que les cellules du modèle ALI restent sur l’insert de support perméable 3,19,20,21, encore d’autres grattent les cellules de l’insert de support perméable et les imagent en suspension dans les milieux 4,6,13.
En outre, l’application plus large des techniques de mesure de la fonction ciliaire est limitée par l’extrême susceptibilité de la fonction ciliaire aux changements dans les facteurs environnementaux. Des facteurs environnementaux tels que la température 22, l’humidité 23,24 et le pH 25,26 influencent la fonction ciliaire et doivent être régulés pour quantifier le CBF avec précision. Les différents paramètres physiologiques utilisés dans différents laboratoires et leur influence sur le FBC ont été examinés précédemment27.
Diverses technologies d’imagerie et approches de mesure CBF sont rapportées dans la littérature. Pour le diagnostic PCD, la microscopie vidéo est utilisée pour mesurer la fonction ciliaire28,29. Récemment, un algorithme d’analyse vidéo basé sur la microscopie dynamique différentielle a été utilisé pour quantifier la coordination CBF et des cils dans les modèles ALI des cellules épithélialesdes voies respiratoires 3,30. Cette méthode permet de caractériser les battements ciliaires dans les cellules épithéliales des voies respiratoires de manière rapide et entièrement automatisée, sans qu’il soit nécessaire de segmenter ou de sélectionner des régions. Diverses méthodes d’imagerie et de quantification du FBC peuvent s’ajouter aux différences signalées dans le FLC dans la littérature (dossier supplémentaire 1).
Un protocole allant de la culture à la quantification pour rationaliser les méthodes existantes, la normalisation des conditions de culture et l’acquisition d’images, effectué dans des conditions environnementales strictes contrôlées, permettrait une quantification cohérente et reproductible du FBC au sein des individus et entre eux.
Ce protocole fournit une description complète de la collecte de cellules épithéliales, des conditions de culture d’expansion et de différenciation et de la quantification du CBF dans trois systèmes différents de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires d’origine nasale : 1) des feuilles épithéliales natives, 2) des modèles ALI imagés sur des inserts de support perméables et 3) des organoïdes tridimensionnels intégrés à la matrice extracellulaire (ECM) (Figure 1 ). Les cellules épithéliales nasales obtenues à partir de brossages de cornets nasaux inférieurs sont utilisées comme représentants de l’épithélium des voies respiratoires, car elles constituent un substitut efficace pour les cellules épithéliales bronchiques31 tout en surmontant la procédure invasive associée à la collecte des brossages bronchiques. La méthode de cellule de reprogrammation conditionnelle (CRC) est utilisée pour développer les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires pour la création de modèles ALI et d’organoïdes tridimensionnels. La reprogrammation conditionnelle des cellules épithéliales des voies respiratoires à un état semblable à celui des cellules souches est induite par co-culture avec le système de cellules nourricières de fibroblastes arrêté par croissance et l’inhibiteur de la kinase associée à Rho (ROCK)32. Il est important de noter que la méthode du CCR augmente le doublement de la population dans les cellules épithéliales des voies respiratoires tout en conservant leur potentiel de différenciation tissulairespécifique 33,34. Dans tous les modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires, la fonction ciliaire est capturée dans une chambre à température contrôlée à l’aide d’une caméra vidéo haute vitesse avec des paramètres d’acquisition d’image standardisés. Des scripts personnalisés sont utilisés pour la quantification du CBF.
Figure 1 : Schéma du flux de travail. Après le brossage du turbiné inférieur nasal des participants, les cellules épithéliales des voies respiratoires sont utilisées de deux façons. Soit les feuilles épithéliales des voies respiratoires sont isolées et la fréquence des battements de cils est imagée immédiatement, soit les cellules épithéliales des voies respiratoires sont étendues via la méthode des cellules de reprogrammation conditionnelle. Les cellules épithéliales des voies respiratoires élargies par le CRC sont différenciées pour établir des cellules épithéliales des voies respiratoires à une interface air-liquide ou des cultures organoïdes épithéliales des voies respiratoires. L’imagerie de la fréquence des battements ciliaires est acquise à l’aide d’un microscope d’imagerie à cellules vivantes avec une chambre environnementale de chauffage et d’humidité et une caméra scientifique à fréquence d’images rapide (>100 Hz). L’analyse des données est effectuée à l’aide de scripts personnalisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe de multiples facteurs qui pourraient obscurcir la quantification du CBF dans les feuillets épithéliaux nasaux. Les feuilles épithéliales doivent être imagées dans les 3 à 9 heures suivant le prélèvement de l’échantillon, car la fonction ciliaire est la plus stable pendant cette période37. Moins de globules rouges et de débris sont les plus optimaux pour l’imagerie, car ils interfèrent avec l’acquisition de données. Lors de la sélection d’un retour sur investissemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les participants à l’étude et leurs familles pour leurs contributions. Nous apprécions l’aide du service respiratoire de Randwick des hôpitaux pour enfants de Sydney (SCH) dans l’organisation et la collecte des échantillons biologiques des patients – un merci spécial au Dr John Widger, à la Dre Yvonne Belessis, à Leanne Plush, à Amanda Thompson et à Rhonda Bell. Nous remercions Iveta Slapetova et Renee Whan de l’installation de microscopie optique Katharina Gaus du Centre d’analyse Mark Wainwright de l’UNSW Sydney. Ce travail est soutenu par le National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), la CF Foundation Australia et la Sydney Children’s Hospital Foundation. Les auteurs tiennent à remercier Luminesce Alliance – Innovation for Children’s Health pour sa contribution et son soutien. Luminesce Alliance – Innovation for Children’s Health est une coentreprise coopérative à but non lucratif entre le Sydney Children’s Hospitals Network, le Children’s Medical Research Institute et le Children’s Cancer Institute. Il a été créé avec le soutien du gouvernement de la Nouvelle-Galles du Sud pour coordonner et intégrer la recherche pédiatrique. Luminesce Alliance est également affiliée à l’Université de Sydney et à l’Université de Nouvelle-Galles du Sud à Sydney. KMA est soutenu par une bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien. LKF est soutenu par le Rotary club de Sydney Cove/Sydney Children’s Hospital Foundation et des bourses d’études supérieures de l’Université UNSW.
Materials
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
| Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
| Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
| Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | Computing software | |
| Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
| rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
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