Här beskriver vi ett protokoll för att skapa utvecklingsrelevanta humana hjärtorganoider (hHOs) effektivt med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller genom självorganisering. Protokollet bygger på sekventiell aktivering av utvecklingssignaler och producerar mycket komplexa, funktionellt relevanta mänskliga hjärtvävnader.
Förmågan att studera mänsklig hjärtutveckling i hälsa och sjukdom är mycket begränsad av förmågan att modellera komplexiteten hos det mänskliga hjärtat in vitro. Att utveckla effektivare organliknande plattformar som kan modellera komplexa in vivo-fenotyper , såsom organoider och organ-på-ett-chip, kommer att förbättra förmågan att studera mänsklig hjärtutveckling och sjukdom. Detta dokument beskriver ett protokoll för att generera mycket komplexa mänskliga hjärtat organoider (hHOs) genom självorganisering med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller och stegvis utvecklingsmässiga utbildningsaktivering med hjälp av små molekylhämmare. Embryoidkroppar (EBs) genereras i en 96-brunnsplatta med rundbottnade, ultralåga fästbrunnar, vilket underlättar suspensionskulturen hos individualiserade konstruktioner.
EBs genomgår differentiering i hHOs genom en tre-steg Wnt signalering modulering strategi, som innebär en första Wnt utbildnings aktivering för att inducera hjärt mesoderm öde, ett andra steg av Wnt hämning för att skapa slutgiltiga hjärt härstamningar och en tredje Wnt aktivering steg för att inducera proepicardial organ vävnader. Dessa steg, utförda i ett 96-brunnsformat, är mycket effektiva, reproducerbara och producerar stora mängder organoider per körning. Analys av immunofluorescens imaging från dag 3 till dag 11 av differentiering avslöjar första och andra hjärtat fält specifikationer och mycket komplexa vävnader inuti hHOs dag 15, inklusive hjärtmuskel vävnad med regioner av förmakscancer och ventrikulärt kardiomyocyter, samt inre kammare fodrade med endokardial vävnad. Organoiderna uppvisar också ett invecklat vaskulär nätverk genom hela strukturen och ett yttre foder av epicardial vävnad. Ur funktionell synvinkel slår hHOs robust och presenterar normal kalciumaktivitet som bestäms av Fluo-4 live imaging. Sammantaget utgör detta protokoll en solid plattform för in vitro-studier i mänskliga organliknande hjärtvävnader.
Medfödda hjärtfel (CHD) är den vanligaste typen av medfödd defekt hos människor och påverkar cirka 1% av alla levande födda1,2,3. Under de flesta omständigheter är orsakerna till chd fortfarande okända. Förmågan att skapa mänskliga hjärtmodeller i labbet som liknar det utvecklande mänskliga hjärtat utgör ett viktigt steg framåt för att direkt studera de underliggande orsakerna till CHD hos människor snarare än i surrogatdjurmodeller.
Symbolen för laboratorieodlade vävnadsmodeller är organoider, 3D-cellkonstruktioner som liknar ett organ av intresse för cellsammansättning och fysiologisk funktion. Organoider härrör ofta från stamceller eller stamceller och har framgångsrikt använts för att modellera många organ som hjärnan4,5, njure6,7, tarm8,9, lung10,11, lever12,13 och bukspottkörtel14,15 , bara för att nämna några. Nyligen genomförda studier har dykt upp som visar möjligheten att skapa självmonterande hjärtorganoider för att studera hjärtutveckling in vitro. Dessa modeller inkluderar användning av mus embryonala stamceller (mESCs) för att modellera tidig hjärtutveckling16,17 upp till atrioventrikulär specifikation18 och mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) för att generera multi-bakterie lager hjärt-endoderm organoider19 och kammade kardioider20 med mycket komplex cellulär sammansättning.
Detta dokument presenterar ett nytt 3-stegs WNT modulering protokoll för att generera mycket komplexa hHOs på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt. Organoider genereras i 96-brunnsplattor, vilket resulterar i ett skalbart system med hög genomströmning som enkelt kan automatiseras. Denna metod bygger på att skapa hPSC aggregat och utlösa utvecklingsmässiga steg av cardiogenesis, inklusive mesoderm och hjärt mesoderm bildandet, första och andra hjärtat fält specifikation, proepicardial organ bildas och atrioventricular specifikation. Efter 15 dagar av differentiering innehåller hHOs alla större cell härstamningar som finns i hjärtat, väldefinierade inre kammare, förmakscelliga och ventrikulära kammare och ett vaskulär nätverk i hela organoiden. Detta mycket sofistikerade och reproducerbara hjärtorganoidsystem är mottagligt för att undersöka strukturella, funktionella, molekylära och transkriptomiska analyser i studien av hjärtutveckling och sjukdomar och farmakologisk screening.
De senaste framstegen inom humana stamcellsbaserade kardiomyocyter och andra celler av hjärtursprung har använts för att modellera mänsklig hjärtutveckling22,24,25 och sjukdom26,27,28 och som verktyg för att screena terapeutiska läkemedel29,30 och giftiga <sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer K01HL135464 och R01HL151505 och av American Heart Association under tilldelningsnummer 19IPLOI34660342. Vi vill tacka MSU Advanced Microscopy Core och Dr. William Jackson vid MSU Department of Pharmacology and Toxicology för tillgång till konfokala mikroskop, IQ Microscopy Core och MSU Genomics Core för sekvenseringstjänster. Vi vill också tacka alla medlemmar i Aguirre Lab för deras värdefulla kommentarer och råd.
Antibodies | |||
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
Media and Reagents | |||
Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
Other | |||
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
ImageJ | NIH | Image processing software | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |