Aplicación del movimiento pasivo de la cabeza para generar aceleraciones definidas en las cabezas de roedores
Summary
El presente protocolo describe un sistema de “movimiento pasivo de la cabeza” diseñado a medida, que reproduce aceleraciones mecánicas en las cabezas de los roedores generadas durante su carrera en cinta a velocidades moderadas. Permite diseccionar factores/elementos mecánicos de los efectos beneficiosos del ejercicio físico.
Abstract
El ejercicio es ampliamente reconocido como eficaz para diversas enfermedades y trastornos físicos, incluidos los relacionados con la disfunción cerebral. Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de los efectos beneficiosos del ejercicio son poco conocidos. Muchos entrenamientos físicos, particularmente aquellos clasificados como ejercicios aeróbicos como trotar y caminar, producen fuerzas impulsivas en el momento del contacto del pie con el suelo. Por lo tanto, se especuló que el impacto mecánico podría estar implicado en cómo el ejercicio contribuye a la homeostasis del organismo. Para probar esta hipótesis en el cerebro, se desarrolló un sistema de “movimiento pasivo de la cabeza” diseñado a medida (en adelante, PHM) que puede generar aceleraciones verticales con magnitudes y modos controlados y definidos y reproducir la estimulación mecánica que podría aplicarse a las cabezas de los roedores durante la carrera en cinta a velocidades moderadas, una intervención típica para probar los efectos del ejercicio en animales. Mediante el uso de este sistema, se demostró que PHM recapitula la serotonina (5-hidroxitriptamina, en lo sucesivo denominada 5-HT) receptor subtipo 2A (5-HT2A) señalización en las neuronas de la corteza prefrontal (PFC) de ratones. Este trabajo proporciona protocolos detallados para aplicar PHM y medir sus aceleraciones mecánicas resultantes en las cabezas de los roedores.
Introduction
El ejercicio es beneficioso para tratar o prevenir varios trastornos físicos, incluyendo enfermedades del estilo de vida como la diabetes mellitus y la hipertensión esencial1. En relación con esto, también se han acumulado evidencias sobre los efectos positivos del ejercicio sobre las funciones cerebrales2. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a los beneficios del ejercicio para el cerebro siguen siendo principalmente no dilucidados. La mayoría de las actividades físicas y entrenamientos generan aceleraciones mecánicas en la cabeza, al menos hasta cierto punto. Mientras que diversos fenómenos fisiológicos están regulados mecánicamente, la importancia de la carga mecánica ha sido, en la mayoría de los casos, documentada en el sistema musculoesquelético 3,4,5. Aunque el cerebro también está sujeto a fuerzas mecánicas durante las actividades físicas, particularmente los llamados ejercicios de impacto, la regulación mecánica de la función cerebral fisiológica rara vez se ha estudiado. Debido a que la generación de aceleraciones mecánicas en la cabeza es relativamente común en los entrenamientos físicos, se ha especulado que la regulación mecánica podría estar implicada en los beneficios del ejercicio para las funciones cerebrales.
La señalización del receptor 5-HT2A es esencial para regular las emociones y los comportamientos entre varias señales bioquímicas que funcionan en el sistema nervioso. Está implicada en múltiples enfermedades psiquiátricas 6,7,8, en las cuales el ejercicio ha demostrado ser terapéuticamente eficaz. El receptor 5-HT2A es un subtipo del receptor 5-HT2 que pertenece a la familia de la serotonina y también es miembro de la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), cuya señalización está modulada por su internalización, ya sea dependiente del ligando o independiente9. Las contracciones de la cabeza son un comportamiento característico de los roedores, cuya cantidad (frecuencia) representa explícitamente la intensidad de la señalización del receptor 5-HT2A en sus neuronas de la corteza prefrontal (PFC)10,11. Aprovechando la estricta especificidad de esta respuesta alucinógena a la 5-HT administrada (respuesta de contracción de la cabeza, en adelante HTR; ver Película Suplementaria 1), se probó la hipótesis mencionada anteriormente sobre las implicaciones mecánicas en los efectos del ejercicio sobre las funciones cerebrales. Por lo tanto, analizamos y comparamos el HTR de ratones sometidos a ejercicio forzado (carrera en cinta rodante) o intervención mecánica que imita el ejercicio (PHM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando el sistema de aplicación PHM desarrollado, hemos demostrado que la señalización 5-HT en sus neuronas PFC está regulada mecánicamente. Debido a la complejidad de los efectos del ejercicio, ha sido difícil diseccionar con precisión las consecuencias del ejercicio en el contexto de la promoción de la salud. La atención se centra en los aspectos mecánicos para evitar la participación o contribución de eventos metabólicos que pueden ocurrir con o posteriormente a las actividades de ejercicio, como el c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor fue apoyada en parte por el Fondo de Investigación Intramuros del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar del Japón; Subvenciones para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Programa apoyado por MEXT para la Fundación de Investigación Estratégica en Universidades Privadas, 2015-2019 del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (S1511017); la Fundación Naito de Ciencia e Ingeniería. Esta investigación también recibió fondos de la Alianza para la Investigación y Capacitación en Rehabilitación Regenerativa (AR3T), que cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver (NICHD), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) y el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P2CHD086843.
Materials
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
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