A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização
Summary
Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.
Abstract
As inovações terapêuticas atuais, como a terapia com células CAR-T, são fortemente dependentes da entrega de genes mediados por vírus. Embora eficiente, essa técnica é acompanhada por altos custos de fabricação, o que trouxe um interesse em usar métodos alternativos para a entrega de genes. A eletroporação é uma abordagem eletrofísica e não viral para a entrega intracelular de genes e outros materiais exógenos. Após a aplicação de um campo elétrico, a membrana celular permite temporariamente a entrega molecular na célula. Normalmente, a eletroporação é realizada em macroescala para processar um grande número de células. No entanto, essa abordagem requer um extenso desenvolvimento de protocolo empírico, o que é caro quando se trabalha com tipos de células primárias e difíceis de transfectar. O longo desenvolvimento de protocolos, juntamente com a exigência de grandes tensões para alcançar forças de campo elétrico suficientes para permeabilizar as células, levou ao desenvolvimento de dispositivos de eletroporação em microescala. Esses dispositivos de microeletroporação são fabricados usando técnicas comuns de microfabricação e permitem um maior controle experimental com o potencial de manter altas capacidades de rendimento. Este trabalho baseia-se em uma tecnologia de microfluídico-eletroporação capaz de detectar o nível de permeabilização da membrana celular em um nível de célula única sob fluxo contínuo. No entanto, essa tecnologia foi limitada a 4 células processadas por segundo e, portanto, uma nova abordagem para aumentar a taxa de transferência do sistema é proposta e apresentada aqui. Esta nova técnica, denotada como controle de feedback baseado na população celular, considera a resposta de permeabilização celular a uma variedade de condições de pulsação de eletroporação e determina as condições de pulso de eletroporação mais adequadas para o tipo de célula em teste. Um modo de maior rendimento é então usado, onde esse pulso “ideal” é aplicado à suspensão celular em trânsito. As etapas para fabricar o dispositivo, configurar e executar os experimentos microfluídicos e analisar os resultados são apresentadas em detalhes. Finalmente, esta tecnologia de micro-eletroporação é demonstrada através da entrega de um plasmídeo de DNA codificando para proteína fluorescente verde (GFP) em células HEK293.
Introduction
As inovações terapêuticas atuais na pesquisa biomédica, como a terapia celular CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) e a edição genética usando CRISPR (sequências de DNA palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas)/Cas9, dependem fortemente da capacidade de fornecer material exógeno com sucesso e eficiência no espaço intracelular1. Na terapia CAR-T, o padrão-ouro para realizar a etapa de entrega gênica na fabricação da terapia celular é o uso de vetores virais2. Embora a entrega de genes mediada por vírus seja uma modalidade de entrega eficiente, ela também tem várias desvantagens. Estes incluem custos de fabricação, citotoxicidade, imunogenicidade, potencial de mutagênese/tumorigênese e limitações de tamanho no(s) gene(s) a ser entregue(s)3. Essas limitações levaram à pesquisa e desenvolvimento de tecnologias alternativas de entrega não viral.
A eletroporação, uma alternativa à entrega de genes mediados por vírus, depende da aplicação de uma forma de onda de pulso elétrico ideal para realizar transfecções de DNA, RNA e proteínas das células. Após a aplicação de um campo elétrico externo, a membrana celular é brevemente comprometida, tornando a célula suscetível à entrega intracelular de materiais exógenos de outra forma impermeáveis4. Em comparação com a entrega mediada por vírus, a eletroporação é vantajosa, pois geralmente é segura, fácil de operar e tem baixos custos operacionais. A eletroporação pode fornecer carga molecular pequena e grande e pode ser eficiente na transfecção de células, independentemente da linhagem5. Para alcançar resultados desejáveis após a eletroporação, ou seja, boa viabilidade e boa eficiência de eletrotransfecção, uma variedade de parâmetros experimentais precisa ser co-otimizada. Estes incluem o tipo de célula6, densidade celular, concentração de molécula7, propriedades tampão de eletroporação (por exemplo, composição molecular, condutividade e osmolaridade)8, tamanho/geometria do eletrodo9 e forma de onda de pulso elétrico (forma, polaridade, número de pulsos)10 (consulte a Figura 1 para ilustração). Embora cada um desses parâmetros possa ter um efeito significativo nos resultados de experimentos de eletroporação, a forma de onda de pulso tem sido especialmente estudada em grande detalhe, pois a energia elétrica do(s) pulso(s) aplicado(s) é a raiz do trade-off intrínseco entre a viabilidade celular resultante e a eficiência de eletrotransfecção8.
Normalmente, os experimentos de eletroporação são realizados em macroescala, onde as células são suspensas em 100s de microlitros de tampão entre um conjunto de eletrodos grandes de placa paralela dentro de uma cubeta de eletroporação. Os eletrodos são comumente fabricados em alumínio com uma distância de eletrodo de 1-4 mm. Uma vez que as células são carregadas manualmente via pipeta, a cubeta é eletricamente conectada a um gerador de pulso elétrico volumoso, onde o usuário pode definir e aplicar os parâmetros de forma de onda de pulso para eletroporar a suspensão celular. Embora a macroescala ou a eletroporação a granel possam processar densidades celulares >106 células/mL, esse recurso pode ser um desperdício ao otimizar as configurações de forma de onda de pulso elétrico. Isso é particularmente preocupante ao eletroporar tipos de células primárias, onde o número de populações celulares pode ser limitado. Além disso, devido à grande distância entre os eletrodos, o gerador de pulso deve ser capaz de fornecer grandes tensões para alcançar intensidades de campo elétrico >1kV/cm11. Essas altas tensões causam dissipação de energia resistiva através do tampão eletrolítico, resultando em aquecimento de Joule, o que pode ser prejudicial à viabilidade celular resultante12. Por fim, a realização de eletroporação em uma densa suspensão de células será consistentemente sobrecarregada com uma variabilidade inata na eficiência de eletrotransfecção resultante e na viabilidade celular. Cada célula em suspensão poderia experimentar uma força de campo elétrico diferente devido às células circundantes. Dependendo se a intensidade do campo elétrico experimentado é aumentada ou diminuída, a viabilidade celular resultante ou a eficiência de eletrotransfecção podem ser impactadas negativamente11. Essas desvantagens da eletroporação em macroescala levaram à busca e ao desenvolvimento de tecnologias alternativas que operam em microescala e permitem um melhor controle no nível de célula única.
O campo do BioMEMS, ou sistemas micro-eletromecânicos biomédicos, decorre dos avanços tecnológicos feitos na indústria de microeletrônica. Especificamente, utilizando processos de microfabricação para desenvolver micro-dispositivos para o avanço da pesquisa biomédica. Esses avanços incluem o desenvolvimento de matrizes de microeletrodos para monitoramento elétrico in vivo13, microeletrodos capacitivos para eletroporação in situ 14, dispositivos miniaturizados de órgão em um chip 15, diagnósticos microfluídicos no ponto de atendimento 16, biossensores 17 e sistemas de liberação de medicamentos 18, incluindo dispositivos de nano e microeletroporação 19,20,21 . Devido à capacidade de projetar e fabricar dispositivos na mesma escala de tamanho que as células biológicas, as tecnologias de nano e microeletroporação são vantajosas quando comparadas à sua contraparte em macroescala22,23. Esses dispositivos de eletroporação eliminam a necessidade de aplicações de pulso de alta tensão, pois os conjuntos de eletrodos com espaçamentos de 10s a 100s de micrômetros são tipicamente integrados. Esta característica reduz drasticamente a corrente através do eletrólito, o que, por sua vez, reduz o acúmulo de produtos de eletrólise tóxicos e os efeitos do aquecimento Joule nesses sistemas. Os canais de microescala também garantem que um campo elétrico muito mais uniforme seja aplicado de forma confiável às células durante a aplicação do pulso, resultando em resultados mais consistentes24. Além disso, também é comum que os dispositivos de microeletroporação sejam integrados em uma plataforma microfluídica que se presta para integração futura em uma tecnologia totalmente automatizada, uma capacidade altamente desejável na fabricação de terapia celular25. Por fim, a eletroporação em microescala permite a interrogação elétrica de eventos de eletroporação. Por exemplo, o grau de permeabilização da membrana celular pode ser monitorado em tempo real em um único nível celular26,27. O objetivo deste método é descrever a microfabricação, a operação do sistema e a análise de um dispositivo microfluídico de microeletroporação de célula única, capaz de medir o grau de permeabilização da membrana celular para otimizar os protocolos de eletroporação, mas aumentando a produtividade em relação ao estado da arte anterior.
A realização de eletroporação em nível de célula única não é mais uma técnica nova, como foi demonstrado pela primeira vez por Rubinsky et al. em 2001 com o desenvolvimento de uma tecnologia de eletroporação de células estáticas28. Seu micro-dispositivo foi inovador, pois eles foram os primeiros a demonstrar a capacidade de monitorar eletricamente o evento de eletroporação. Isso levou ainda ao desenvolvimento de tecnologias estáticas de eletroporação de célula única, capazes de detectar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular de maneira paralelizada para aumentar os rendimentos dos dispositivos. No entanto, mesmo com paralelização e processamento em lote, esses dispositivos carecem severamente do número total de células que podem processar por unidade de tempo29,30. Essa limitação levou ao desenvolvimento de dispositivos de fluxo capazes de realizar microeletroporação em nível de célula única com rendimentos muito maiores31. Essa transição do dispositivo, do ambiente estático para o ambiente de fluxo, limita a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular após a aplicação do pulso de eletroporação. O método descrito neste trabalho preenche a lacuna entre essas duas tecnologias, uma tecnologia de microeletroporação capaz de detectar eletricamente, pulsar e monitorar o grau de permeabilização da membrana celular de células individuais, de fluxo contínuo e seriado.
Esta tecnologia foi recentemente descrita em Zheng et al. Nesse trabalho, as capacidades dessa tecnologia foram introduzidas com a conclusão de um estudo paramétrico, onde tanto a amplitude quanto a duração do pulso de eletroporação foram variadas, e o sinal elétrico subsequente, indicativo de permeabilização da membrana celular, foi explorado32. Os resultados mostraram que um aumento na intensidade do pulso de eletroporação (ou seja, aumento no campo elétrico aplicado ou aumento na duração do pulso) causou um aumento na permeabilização da membrana celular medida. Para validar ainda mais o sistema, um indicador fluorescente comum de eletroporação bem-sucedida, iodeto de propídio33, foi adicionado à suspensão celular, e uma imagem de fluorescência foi capturada imediatamente após a aplicação do pulso elétrico. O sinal óptico, ou seja, a intensidade de fluorescência do iodeto de propídio no interior da célula, correlacionou-se fortemente com a medida elétrica do grau de permeabilização da membrana celular, verificando-se a confiabilidade dessa medida elétrica. No entanto, este trabalho considerou apenas a entrega da pequena molécula de iodeto de propídio, que tem pouco ou nenhum significado traduzível.
Neste trabalho, uma nova aplicação desta tecnologia é introduzida para melhorar o rendimento do sistema, ao mesmo tempo em que fornece um vetor de DNA plasmidial biologicamente ativo (pDNA) e avalia a eficiência de eletrotransfecção de células rechapeadas e cultivadas após a eletroporação. Embora o trabalho anterior supere as tecnologias de micro-eletroporação existentes que são capazes de medir eletricamente o evento de eletroporação, o estado atual do dispositivo ainda requer longos tempos de trânsito celular entre o conjunto de eletrodos (~ 250 ms) para realizar a detecção de células, a aplicação de pulso e a medição de permeabilização da membrana celular. Com um único canal, isso limita a taxa de transferência a 4 células/s. Para combater essa limitação, um novo conceito de eletroporação controlada por feedback baseado na população celular é introduzido para realizar a eletrotransfecção de pDNA. Usando um tampão de eletroporação de condutividade hipofisiológica, este sistema permite a interrogação elétrica de células individuais através de uma infinidade de aplicações de pulso de eletroporação. Com base na resposta elétrica, um pulso de eletroporação “ideal” é então determinado. Um modo de “alto rendimento” é então implementado onde a determinação da permeabilização da membrana celular é anulada, a taxa de fluxo é aumentada e o ciclo de trabalho do pulso de eletroporação é combinado com o tempo de trânsito da célula para garantir um pulso por célula em trânsito entre os eletrodos. Este trabalho fornecerá detalhes extensivos sobre as etapas de microfabricação para a fabricação do microdispositivo, o material / equipamento e sua configuração necessária para realizar a experimentação e a operação / análise do dispositivo e sua eficiência de eletrotransfecção (eTE).
Figura 1: Fatores experimentais que afetam os resultados da eletroporação. (Esquerda) Suspensão Celular – Fatores importantes a serem considerados antes do início da eletroporação incluem: Carga útil (neste caso, pDNA), concentração, densidade celular e propriedades do tampão de eletroporação. As propriedades do tampão de eletroporação a serem consideradas são a condutividade, a osmolaridade e a composição molecular exata que contribui para esses valores. (Meio) Aplicação de pulso – O tipo exato de pulso (onda quadrada vs. decaimento exponencial) e a forma de onda de pulso (pulso único vs. trem de pulso) devem ser otimizados para maximizar a viabilidade celular resultante e a eficiência de eletrotransfecção. Trens de pulso comuns implementados em processos de eletroporação são tipicamente compostos de uma série de pulsos de Alta Tensão (HV) ou séries de pulsos que giram entre as magnitudes de pulso HV e Baixa Tensão (LV). (Direita) Recuperação de células – As etapas de processamento a jusante, em particular, o meio de cultura de células de recuperação para o qual as células são transferidas, devem ser otimizadas. Não apresentado (Extrema Esquerda), etapas adicionais de processamento de células upstream podem ser implementadas para otimização geral do processo de eletroporação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
A metodologia apresentada dentro deste protocolo se concentra principalmente na microfabricação de um dispositivo microfluídico que é então integrado em uma configuração experimental especializada em eletroporação. O termo “receita”, que é frequentemente usado ao descrever as especificidades do processo de microfabricação, sugere a importância de seguir / otimizar cada etapa para fabricar com sucesso um dispositivo funcional. No entanto, certas etapas críticas dentro do processo, quando não otimizadas, com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro da National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) e do Treinamento de Pós-Graduação em Áreas Emergentes de Precisão e Medicina Personalizada do Departamento de Educação dos EUA (P200A150131) para financiar o estudante de pós-graduação J.J.S. em bolsa.
Materials
| 150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
| 24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
| 33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
| 4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
| AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
| Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
| CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
| CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
| Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
| Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
| Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
| Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
| DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
| E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
| Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
| EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
| FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
| Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
| Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
| HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
| HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
| IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
| L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
| MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
| Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
| Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
| Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
| National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
| Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
| PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
| Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
| Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
| PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
| PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
| PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
| SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
| SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
| SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
| Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
| Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
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