Isolamento de Células Epiteliais do Folículo Dental Humano

Summary

O folículo dentário contém uma população epitelial e células mesenquimais. A população epitelial foi selecionada da população heterogênea de folículos dentário, proporcionando um meio de cultura distinto. As células epiteliais sobreviveram e formaram colônias em um meio livre de soro.

Abstract

O folículo dentário (DF) foi colhido durante a remoção de um terceiro molar impactado por um cirurgião maxilofacial oral. O isolamento das células epiteliais foi realizado no dia da colheita do DF. O DF foi lavado três vezes com DPBS e depois dissecado com tesoura de tecido até que o tecido tivesse uma consistência polpa ou macia. Populações unicelulares foram pelotadas por centrifugação e lavadas com meio sem soro de queratinócito. Populações de células heterogêneas foram distribuídas em um prato de cultura. O meio sem soro de queratinócito foi usado para selecionar as células epiteliais. O meio cultural foi alterado diariamente até que não foram observados detritos flutuantes ou células mortas. As células epiteliais apareceram entre 7 e 10 dias após a distribuição da população celular. As células epiteliais sobreviveram em meio livre de soro, enquanto α meio essencial mínimo complementado com soro bovino fetal de 10% permitiu a proliferação de células do tipo mesenquimal. O DF é uma fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método para o isolamento das células epiteliais do DF humano. O ligamento periodontal (PDL) foi utilizado para o isolamento de células epiteliais dentárias humanas. A aquisição de células epiteliais de PDL humano nem sempre é bem sucedida devido ao pequeno volume tecidual, levando a um baixo número de células epiteliais. O DF tem um volume maior que o PDL e contém mais células. O DF pode ser uma fonte tecidual para a cultura primária das células epiteliais dentárias humanas. Este protocolo é mais fácil e eficiente do que o método de isolamento usando PDL. A aquisição de células epiteliais dentárias humanas pode facilitar estudos adicionais de interações epiteliais-mesenquimais dentárias.

Introduction

A formação dentária começa com a invaginação do epitélio ^oral1. De acordo com o estágio de desenvolvimento dentário, o epitélio oral tem nomes diferentes, incluindo epitélio de esmalte interno e externo, laço cervical e bainha de raiz epitelial de Hertwig (HERS). Os compartimentos epiteliais se comunicam com as células mesenquimais circundantes. Interações epiteliais-mesenquimais regulam a formação dentária e a regeneração tecidual. A aquisição de células epiteliais dentárias, como os queratinócitos orais e as células da baia de raiz epitelial de Hertwig (HERSCs), é crucial para o estudo das interações epiteliais-mesenquimais dentárias2.

As células epiteliais dentárias derivadas de roedores são isoladas da estrutura epitelial, como o HERS. Li e colegas isolaram e imortalizaram HERSCs derivados do molar de rato após a colheita da porção apical dos germes dentários em desenvolvimento de ratos de 8 dias de ^idade3. O HERS foi separado do tecido apical sob ampliação. Considerando o estágio e a idade do desenvolvimento dentário, a colheita do HERS de humanos é quase impossível por causa de questões éticas: um germe dentário em desenvolvimento precisa ser removido de uma criança para colher o HERS humano. Germes dentários imaturos raramente são extraídos. As células epiteliais dentárias humanas podem ser isoladas do ligamento gengiva e periodontal (PDL). As células derivadas da estrutura epitelial participam da formação dentária juntamente com componentes mesenquimais e podem ser mais adequadas para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais dentárias do que queratinócitos orais. As células epiteliais de Malassez (ERM) são remanescentes epiteliais derivados do HERS e residem em pequenos números no ^PDL4. Estudos relatam o isolamento de HERSCs humanos do ^PDL5. No entanto, a colheita de HERSCs humanos a partir de tecido PDL nem sempre é bem sucedida devido à escassez da população epitelial neste ^local5,6.

Embora os HERSCs derivados de roedores sejam mantidos em mídias contendo ^soro3,7, as células epiteliais derivadas do DF são cultivadas com mídia livre de soro semelhante a outras células epiteliais humanas, como queratinócitos epidérmicos normais e queratinócitos orais humanos ^normais8,9. Isso implica diferenças fisiológicas ou funcionais entre células epiteliais dentárias de roedores e células epiteliais dentárias humanas. A compreensão do mecanismo relativo às interações epiteliais-mesenquimais dentárias pode contribuir para o desenvolvimento de aplicações clínicas, incluindo recolocação periodontal durante replantação, regeneração periodontal em doença periodontal, regeneração complexa de celulose e geração biodestina. Considerando as características da pesquisa translacional, as células epiteliais dentárias humanas podem ser mais apropriadas do que as células epiteliais de roedores para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais.

O DF humano é um tecido conjuntivo solto e muitas vezes reside em um dente impactado. O DF contém precursores ^{mesenquimais10}. No entanto, até onde sabemos, nenhum estudo relatou o isolamento de células epiteliais de folículos dentários antes de 2021. Oh e Yi relataram o isolamento das células epiteliais do DF humano em 20218. O fenótipo epitelial foi confirmado por manchas ocidentais e análise morfológica. A análise da origem das células epiteliais derivadas do DF demonstrou resultados semelhantes com outros estudos. As células epiteliais derivadas do DF não eram nem endoteliais nem hematopoiéticas5,11, e Oh e Yi sugeriram nomear essas células como DF-HERSCs. O DF tem um volume maior que o PDL, e mais células epiteliais podem ser isoladas do DF. Isso aumenta o surgimento de colônias epiteliais e resulta em uma alta taxa de sucesso na colheita de células epiteliais do DF. Este estudo sugere o uso do DF como fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.

No presente estudo, as células únicas foram isoladas do DF de acordo com os procedimentos descritos ^{anteriormente10,12}. O DF contém populações de células heterogêneas, e vários tipos de células podem estar presentes na fase inicial do procedimento. Morsczek e colegas isolaram células-tronco mesenquimais derivadas do ^DF10. Nós imaginamos que o DF contém células epiteliais e que apenas células epiteliais podem sobreviver sob condições livres de soro. Este estudo difere do de Morsczek et al. em termos da seleção da população epitelial e da inibição das células mesenquimais. A seleção foi realizada utilizando-se uma mídia sem soro de queratinócito (SFM), que permite a proliferação de células epiteliais e inibe a proliferação de células mesenquimais. Este estudo teve origem em um relatório de Oh e ^Yi8. O objetivo deste estudo foi descrever detalhes do método utilizado nesse relatório para o isolamento de células epiteliais do DF humano.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Universitário Kyung Hee em Gangdong (aprovação do IRB nº. KHNMC 2017-06-009). 1. Recolher DF NOTA: Os pacientes deram consentimento informado antes da cirurgia para a remoção de um terceiro molar maduro ou imaturo impactado. Foram excluídos pacientes com a seguinte doença: diabetes, hipertensão, tuberculose, hepatite, síndrome da imunodeficiência adquirida. As gest…

Representative Results

Colheita do DFA cirurgia foi realizada por um cirurgião maxilofacial oral. Materiais derivados do homem, incluindo o fragmento dentário, tecido gengival e DF, foram coletados por um cirurgião (Figura 1A). O DF pode estar preso ao fragmento de dente. Um cirurgião maxilofacial oral será capaz de identificar o DF. A cooperação e a comunicação com o cirurgião são necessárias para a coleta de tecidos. O DF é um tecido de membrana em forma irregular. O tecido geng…

Discussion

Este protocolo inclui etapas críticas. A colheita de populações unicelulares é essencial para o isolamento bem sucedido das células epiteliais do DF. Procuramos isolar células epiteliais do DF com base em nossa hipótese de que há mais células epiteliais no DF. O procedimento de picar aumenta o desprendimento e a liberação de células do DF. O procedimento de picar foi melhorado, e o picar se repetiu até que o DF apareceu polpa para facilitar a liberação de células únicas. A obtenção do número máximo d…

Materials

EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease