Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën
Summary
Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.
Abstract
Retinopathieën zijn een heterogene groep ziekten die het neurosensorische weefsel van het oog aantasten. Ze worden gekenmerkt door neurodegeneratie, gliose en een progressieve verandering in vasculaire functie en structuur. Hoewel het begin van de retinopathieën wordt gekenmerkt door subtiele verstoringen in de visuele waarneming, zijn de wijzigingen in de vasculaire plexus de eerste tekenen die door clinici worden gedetecteerd. De afwezigheid of aanwezigheid van neovascularisatie bepaalt of de retinopathie wordt geclassificeerd als niet-proliferatief (NPDR) of proliferatief (PDR). In die zin probeerden verschillende diermodellen specifieke vasculaire kenmerken van elke fase na te bootsen om de onderliggende mechanismen te bepalen die betrokken zijn bij endotheelveranderingen, neuronale dood en andere gebeurtenissen die plaatsvinden in het netvlies. In dit artikel zullen we een volledige beschrijving geven van de procedures die nodig zijn voor het meten van retinale vasculaire parameters bij volwassenen en vroeggeboorte muizen op postnatale dag (P) 17. We zullen de protocollen beschrijven om retinale vasculaire kleuring uit te voeren met Isolectine GSA-IB4 in hele mounts voor latere microscopische visualisatie. Belangrijke stappen voor beeldverwerking met Image J Fiji-software worden ook verstrekt, daarom kunnen de lezers de vaatdichtheid, diameter en tortuositeit, vasculaire vertakking, evenals avasculaire en neovasculaire gebieden meten. Deze hulpmiddelen zijn zeer nuttig om vasculaire veranderingen in zowel niet-proliferatieve als proliferatieve retinopathieën te evalueren en te kwantificeren.
Introduction
De ogen worden gevoed door twee arterio-veneuze systemen: de choroïdale vasculatuur, een extern vasculair netwerk dat retinaal gepigmenteerd epitheel irrigeert en fotoreceptoren; en de neuro-retinale vasculatuur die de ganglioncellenlaag irrigeert en de binnenste nucleaire laag van het netvlies1. De retinale vasculatuur is een georganiseerd netwerk van bloedvaten die voedingsstoffen en zuurstof leveren aan de retinale cellen en afvalproducten oogsten om een goede visuele signaaltransductie te garanderen. Deze vasculatuur heeft een aantal onderscheidende kenmerken, waaronder: het ontbreken van autonome innervatie, de regulatie van de vasculaire tonus door intrinsieke retinale mechanismen en het bezit van een complexe retinale bloedbarrière2. Daarom is retinale vasculatuur de focus geweest van veel onderzoekers die niet alleen vasculogenese tijdens de ontwikkeling uitgebreid hebben bestudeerd, maar ook de veranderingen en de pathologische angiogenese die deze bloedvaten ondergaan bij ziekten3. De meest voorkomende vasculaire veranderingen waargenomen bij retinopathieën zijn vaatdilatatie, neovascularisatie, verlies van vasculaire arborisatie en vervorming van de retinale hoofdvaten, waardoor ze meer ziggaggy worden4,5,6. Een of meer van de beschreven veranderingen zijn de vroegste tekenen die door clinici worden gedetecteerd. Vasculaire visualisatie biedt een snelle, niet-invasieve en goedkope screeningsmethode7. De uitgebreide studie van de waargenomen veranderingen in de vasculaire boom zal bepalen of de retinopathie niet-proliferatief of proliferatief is en de verdere behandeling. De niet-proliferatieve retinopathieën kunnen zich manifesteren met afwijkende vasculaire morfologie, verminderde vasculaire dichtheid, acellulaire haarvaten, pericytendood, macula-oedeem, onder anderen. Bovendien ontwikkelen proliferatieve retinopathieën ook een verhoogde vasculaire permeabiliteit, extracellulaire remodellering en de vorming van vasculaire plukjes naar de glasvochtholte die gemakkelijk afbreken of netvliesloslating veroorzaken8.
Eenmaal gedetecteerd, kan de retinopathie worden gecontroleerd door middel van zijn vasculaire veranderingen9,10. De progressie van de pathologie kan worden gevolgd door de structurele veranderingen van de bloedvaten, die duidelijk de stadia van de ziekte definiëren11. De kwantificering van vasculaire veranderingen in deze modellen maakte het mogelijk om vaatveranderingen en neuronale dood te correleren en farmacologische therapieën te testen voor patiënten in verschillende fasen van de ziekte.
In het licht van de bovenstaande verklaringen zijn wij van mening dat de herkenning en kwantificering van vasculaire veranderingen fundamenteel zijn in retinopathieënstudies. In dit werk zullen we laten zien hoe verschillende vasculaire parameters kunnen worden gemeten. Daarvoor gebruiken we twee diermodellen. Een daarvan is het zuurstofgeïnduceerde retinopathiemuismodel12, dat retinopathie van prematuriteit en sommige aspecten van proliferatieve diabetische retinopathie nabootst13,14. In dit model meten we avasculaire gebieden, neovasculaire gebieden en de dilatatie en tortuositeit van hoofdvaten. In ons laboratorium is een metabool syndroom (MetS) muismodel ontwikkeld, dat een niet-proliferatieve retinopathie induceert15. Hier zullen we de vasculaire dichtheid en vertakking evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diermodellen van retinopathieën zijn krachtige hulpmiddelen voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling, remodellering of pathologische angiogenese. Het succes van deze studies in het veld is afhankelijk van de gemakkelijke toegang tot het weefsel dat het mogelijk maakt om een breed scala aan technieken uit te voeren, waarbij gegevens van in vivo en postmortale muizen worden verstrekt26,27. Bovendien is er een grote correlatie gevonden tuss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Carlos Mas, María Pilar Crespo en Cecilia Sampedro van CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinië) voor hulp bij confocale microscopie, aan Soledad Miró en Victoria Blanco voor toegewijde dierenverzorging en Laura Gatica voor histologische hulp. We danken ook Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication van FCQ) voor de videoproductie en -editie en Paul Hobson voor zijn kritische lezing en taalrevisie van het manuscript.
Dit artikel werd gefinancierd door subsidies van Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (allemaal naar M.C.S.).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O’Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
