Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente
Summary
Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.
Abstract
Atherosklerose ist eine entzündliche Erkrankung der arteriellen Regionen, die einem gestörten Blutfluss (D-Flow) ausgesetzt sind. D-flow reguliert die Expression von Genen im Endothel auf transkriptomischer und epigenomischer Ebene, was zu proatherogenen Reaktionen führt. Vor kurzem wurden Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und Einzelzell-Assay für Transposase Accessible Chromatin Sequencing (scATACseq) Studien durchgeführt, um die transkriptomischen und chromatin-Zugänglichkeitsänderungen bei einer Einzelzellauflösung unter Verwendung des Maus-PCL-Modells (Partial Carotisligation) zu bestimmen. Da Endothelzellen (ECs) nur einen geringen Teil der gesamten Zellpopulationen in der Arterienwand ausmachen, wurde eine luminale Verdauungsmethode verwendet, um EC-angereicherte Einzelzellpräparate zu erhalten. Für diese Studie wurden Mäuse einer PCL-Operation unterzogen, um einen d-Fluss in der linken Halsschlagader (LCA) zu induzieren, während die rechte Halsschlagader (RCA) als Kontrolle verwendet wurde. Die Halsschlagadern wurden zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation seziert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung unterzogen, und endothelial angereicherte Einzelzellen oder einzelne Kerne wurden erhalten. Diese Einzelzell- und Einzelkernpräparate wurden anschließend mit einem 10-fachen mikrofluidischen Aufbau von Genomics mit einem Barcode versehen. Die mit Barcodes versehenen Einzelzellen und Einzelkerne wurden dann für die RNA-Vorbereitung, Bibliotheksgenerierung und Sequenzierung auf einem Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierer verwendet. Nach der bioinformatischen Verarbeitung identifizierten die Datensätze scRNAseq und scATACseq verschiedene Zelltypen aus dem luminalen Aufschluss, die hauptsächlich aus ECs bestanden. Glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Immunzellen waren ebenfalls vorhanden. Diese EC-Anreicherungsmethode half dabei, die Wirkung des Blutflusses auf das Endothel zu verstehen, was mit der Methode der Gesamtarterienverdauung schwierig gewesen sein könnte. Die EC-angereicherte Einzelzellpräparationsmethode kann verwendet werden, um Einzelzell-Omics-Studien an EC-Knockouts und transgenen Mäusen durchzuführen, bei denen die Wirkung des Blutflusses auf diese Gene nicht untersucht wurde. Wichtig ist, dass diese Technik angepasst werden kann, um EC-angereicherte Einzelzellen aus menschlichen Arterienexplantaten zu isolieren, um ähnliche mechanistische Studien durchzuführen.
Introduction
Dieses Labor zeigte zuvor, dass die Induktion von d-flow zu einer schnellen und robusten Atheroskleroseentwicklung bei hyperlipidämischen Mäusen führt 1,2. Das neuartige Mausmodell der d-Flow-induzierten Atherosklerose wurde mittels partieller Carotisligatur (PCL) möglich 3. Die PCL-Chirurgie induziert einen niedrigen und oszillatorischen Blutfluss oder D-Fluss in der ligierten linken Halsschlagader (LCA). Im Gegensatz dazu ist die kontralaterale rechte Halsschlagader (RCA) weiterhin einer stabilen laminaren Strömung (s-flow) ausgesetzt. Um die Wirkung des d-Flusses auf Endothelzellen zu verstehen, wurden die Halsschlagadern nach einer partiellen Ligaturoperation seziert und mit einem auf Phenol- und Guanidinisothiocyanat basierenden Lysemittel (luminale RNA/DNA-Spülmethode)2,4 gespült, das endothelial angereicherte “gepoolte Bulk”-RNAs oder DNAs lieferte. Diese gepoolten Bulk-RNAs oder DNAs wurden dann für transkriptomische Studien oder epigenomische DNA-Methylom-Studien bzw. 4,5,6 verarbeitet. Diese Studien halfen, mehrere flussempfindliche Gene und microRNAs zu entdecken, deren Rolle in der Endothelbiologie und Atherosklerose umfassend untersucht wurde 4,6,7.
Trotz der endothelialen Anreicherung konnten diese RNA/DNA-Massenstudien jedoch nicht die spezifische Rolle jedes Zelltyps in der Arterienwand bei d-flow-induzierter Atherosklerose unterscheiden. Umdiese Einschränkung zu überwinden, wurden endothelial angereicherte Einzelzellisolierungen (sc) sowie scRNA- und scATAC-Sequenzierungsstudien durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden C57Bl6-Mäuse der PCL-Operation unterzogen, um einen d-Flow in der LCA zu induzieren, während die s-flow-exponierte RCA als Kontrolle verwendet wurde. Zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation wurden die Mäuse geopfert und die Halsschlagader seziert und gereinigt. Das Lumen sowohl von LCAs als auch von RCAs wurde mit Kollagenase infundiert, und die luminalen Kollagenase-Verdauungen, die ECs als signifikante Fraktion enthielten, und andere arterielle Zellen wurden gesammelt. Die Einzelzellsuspension (scRNAseq) oder Einzelkernsuspension (scATACseq) wurde hergestellt und mit eindeutigen Identifikatoren für jede Zelle oder jeden Kern unter Verwendung eines 10-fachen Genomics-Setups versehen. Die RNAs wurden einer cDNA-Bibliotheksvorbereitung unterzogen und sequenziert.
Die Datensätze scRNAseq und scATACseq wurden mit der Cell Ranger Single-Cell Software verarbeitet und von den Seurat und Signac R Paketen 9,10 weiter analysiert. Jeder Zelle und jedem Zellkern wurde aus diesen Analysen ein Zelltyp zugeordnet und basierend auf den Markergenen und einzigartigen Genexpressionsmustern in den Zelltyp gruppiert. Die Ergebnisse der scRNAseq und scATACseq zeigten, dass diese Einzelzellpräparate mit ECs angereichert sind und auch glatte Muskelzellen (SMCs), Fibroblasten und Immunzellen enthalten.
Weitere Analysen ergaben, dass die EC-Population in der luminalen Verdauung sehr divergent und plastisch (8 verschiedene EC-Cluster) ist und auf den Blutfluss reagiert. Am wichtigsten ist, dass diese Ergebnisse zeigten, dass d-flow ECs von einem athero-geschützten entzündungshemmenden Phänotyp zu pro-atherogenen Phänotypen umprogrammiert, einschließlich entzündungsförderndem, endothelialem zu mesenchymalem Übergang, endothelialem Stamm / Vorläuferzellübergang und überraschenderweise endothelial-zu-immunzellähnlichem Übergang. Darüber hinaus zeigen scATACseq-Daten genomweit neuartige flussabhängige Chromatin-Zugänglichkeitsänderungen und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, die die Grundlage für mehrere neue Hypothesen bilden. Die Methodik und das Protokoll zur Vorbereitung einzelner Endothelzellen für Einzelzell-Multi-Omics-Studien aus den Halsschlagadern der Maus sind unten aufgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Einzelzellpräparaten aus den Halsschlagadern der Maus. Der Einfluss von d-flow auf die Endothelzellen kann genau untersucht werden, wenn die PCL-Operation korrekt durchgeführt wird. Es ist wichtig, die Äste der gewöhnlichen Halsschlagader, wie die äußere Halsschlagader, die innere Halsschlagader, die Okzipitalarterie und die Arteria thyroidea superior, korrekt zu identifizieren. Die Validierung von Strömungsmustern durch Ultraschall val…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health-Zuschüsse HL119798, HL095070 und HL139757 an HJ unterstützt. HJ wird auch von der Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship unterstützt. Die Dienstleistungen des Emory Integrated Genomics Core (EIGC) wurden von der Emory University School of Medicine subventioniert und teilweise auch von der Georgia Clinical and Translational Science Alliance der National Institutes of Health unter der Award-Nr. UL1TR002378. Der oben bereitgestellte Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O’Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
