حقن خلايا السدى المشتقة من الأنسجة الدهنية من لحم الخنزير عن طريق تقنية Waterjet
Summary
نحن نقدم طريقة لحقن الخلايا عبر تقنية Waterjet الخالية من الإبر إلى جانب تكملة من تحقيقات ما بعد الولادة من حيث الجدوى الخلوية والانتشار وقياسات المرونة.
Abstract
سلس البول (UI) هو حالة منتشرة للغاية تتميز بنقص العضلة العاصرة للإحليل. فروع الطب التجديدي ، وخاصة العلاج الخلوي ، هي أساليب جديدة لتحسين واستعادة وظيفة العضلة العاصرة للإحليل. على الرغم من أن حقن الخلايا الوظيفية النشطة يتم إجراؤه بشكل روتيني في الإعدادات السريرية عن طريق الإبرة والحقنة ، إلا أن هذه الأساليب لها عيوب وقيود كبيرة. في هذا السياق ، تعد تقنية Waterjet الخالية من الإبر (WJ) طريقة مجدية ومبتكرة يمكنها حقن خلايا قابلة للحياة عن طريق تنظير المثانة الموجه بصريا في العضلة العاصرة للإحليل. في هذه الدراسة ، استخدمنا WJ لتوصيل الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSCs) إلى أنسجة مجرى البول الجثة، ثم حققنا في تأثير توصيل WJ على إنتاجية الخلايا وقابليتها للحياة. قمنا أيضا بتقييم السمات الميكانيكية الحيوية (أي المرونة) بواسطة قياسات مجهر القوة الذرية (AFM). لقد أظهرنا أن PADSC التي قدمتها WJ قد انخفضت بشكل كبير في مرونتها الخلوية. كانت الجدوى أقل بكثير مقارنة بالضوابط ولكنها لا تزال أعلى من 80٪.
Introduction
سلس البول (UI) هو اضطراب واسع الانتشار مع انتشار 1.8 – 30.5 ٪ في السكان الأوروبيين1 ويتميز في المقام الأول عن طريق خلل في العضلة العاصرة للإحليل. من منظور سريري ، غالبا ما يتم تقديم العلاج الجراحي للمرضى عندما تفشل العلاجات المحافظة أو العلاج الطبيعي في معالجة الأعراض الناشئة والتخفيف من حدتها.
ظهر العلاج الخلوي للإصلاح التجديدي المحتمل لخلل مجمع العضلة العاصرة كنهج طليعي لعلاج أمراض UI 2,3. أهدافها الرئيسية هي استبدال وإصلاح واستعادة الوظائف البيولوجية للأنسجة التالفة. في النماذج الحيوانية لواجهة المستخدم ، أظهرت زراعة الخلايا الجذعية نتائج واعدة في نتائج ديناميكا البول2،4،5. تنشأ الخلايا الجذعية كمرشحة خلوية مثالية لأنها تتمتع بالقدرة على الخضوع للتجديد الذاتي والتمايز متعدد القدرات ، وبالتالي ، تساعد على تجديد الأنسجة المصابة6. على الرغم من إمكانات التجدد القادمة ، لا يزال الاستخدام العملي للعلاج بالخلايا معوقا لأن توصيل الخلايا بأقل قدر من التدخل الجراحي لا يزال يواجه العديد من التحديات المتعلقة بدقة الحقن وتغطية الهدف. على الرغم من أن النهج الحالي المستخدم لتوصيل الخلايا هو الحقن من خلال نظام حقنة الإبرة7 ، إلا أنه عادة ما يؤدي إلى عجز عام في الخلايا القابلة للحياة ، مع انخفاض الجدوى المبلغ عنها إلى 1٪ – 31٪ بعد الزرع8. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أيضا أن توصيل الخلايا عن طريق حقن الإبرة يؤثر على الوضع ، ومعدل الاحتفاظ ، وكذلك توزيع الخلايا المزروعة في الأنسجة المستهدفة9،10،11. هناك نهج عملي وجديد يتغلب على القيد المذكور أعلاه وهو توصيل الخلايا الخالية من الإبر عبر تقنية المياه النفاثة.
تظهر تقنية Waterjet (WJ) كنهج جديد يتيح توصيل الخلايا عالية الإنتاجية بواسطة منظار المثانة تحت السيطرة البصرية في العضلة العاصرة للإحليل12,13. يتيح WJ توصيل الخلايا عند ضغوط مختلفة (E = تأثيرات في البار) تتراوح من E5 إلى E8013. في المرحلة الأولى ، يتم تطبيق محلول متساوي التوتر (مرحلة اختراق الأنسجة) بضغط عال (أي E60 أو E80) من أجل تخفيف المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأنسجة المستهدفة وفتح ثغرات صغيرة مترابطة صغيرة. في المرحلة الثانية (مرحلة الحقن) ، يتم خفض الضغط في غضون مللي ثانية (أي حتى E10) من أجل توصيل الخلايا بلطف إلى الأنسجة المستهدفة. بعد هذا التطبيق المكون من مرحلتين ، لا تتعرض الخلايا لضغط إضافي ضد الأنسجة عند إخراجها ولكنها تطفو في تيار منخفض الضغط في منطقة كهفية مملوءة بالسائل13. في إعداد نموذج خارج الجسم الحي حيث تم حقن الخلايا الجذعية عبر WJ في أنسجة مجرى البول الجثة، يمكن بعد ذلك شفط الخلايا القابلة للحياة واسترجاعها من الأنسجة وتوسيعها في المختبر13. على الرغم من أن دراسة أجريت عام 2020 من قبل Weber et al. أظهرت جدوى وقابلية تطبيق WJ لتقديم خلايا عضلة القلب الخالية من البصمة في عضلة القلب14 ، إلا أنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن تقنية WJ لا تزال في مرحلة النموذج الأولي.
يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير وتسمية الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSC) وكيفية توصيلها إلى أنسجة سائلة وجثث عبر تقنية WJ وإبر تنظير المثانة من ويليامز (WN). بعد الحقن الخلوي ، يتم تقييم الحيوية الخلوية والمرونة عبر مجهر القوة الذرية (AFM). من خلال تعليمات خطوة بخطوة ، يوفر البروتوكول نهجا واضحا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة. يعرض قسم المناقشة ويصف المزايا الرئيسية والقيود والمنظورات المستقبلية لهذه التقنية. إن تسليم WJ للخلايا بالإضافة إلى تحليلات ما بعد ترجمة التتمة المذكورة هنا تحل محل حقن الإبرة القياسي وتوفر إطارا قويا لتوصيل الخلايا للشفاء التجديدي للأنسجة المستهدفة. في دراساتنا الأخيرة قدمنا أدلة على أن WJ سلمت الخلايا بشكل أكثر دقة وعلى الأقل في قابلية مماثلة عند مقارنتها بحقن الإبرة15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، أظهرنا وقدمنا نهجا خطوة بخطوة لإجراء توصيل خلايا WJ واستخدمنا تكملة من التحقيقات الكمية لتقييم تأثير تسليم WJ على الخصائص الخلوية: الجدوى الخلوية والميزات الميكانيكية الحيوية (أي EM). بعد حقن WJ ، كانت 85.9٪ من الخلايا التي تم حصادها قابلة للحياة. من حيث حقن WN ، احتفظت 97.2٪ من الخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المؤلفين المشاركين من المنشورات الأصلية على مساعدتهم ودعمهم.
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
