Injektion av svin fettvävnads-härledda stromaceller via vattenskärningsteknik
Summary
Vi presenterar en metod för cellinjektion via nålfri vattenskärningsteknik i kombination med en följd av undersökningar efter leverans när det gäller cellulär livskraft, proliferation och elasticitetsmätningar.
Abstract
Urininkontinens (UI) är ett mycket utbrett tillstånd som kännetecknas av brist på urinrörets sfinktermuskel. Regenerativ medicin grenar, särskilt cellterapi, är nya metoder för att förbättra och återställa urinrörets sfinkterfunktion. Även om injektion av aktiva funktionella celler rutinmässigt utförs i kliniska miljöer med nål och spruta, har dessa metoder betydande nackdelar och begränsningar. I detta sammanhang är nålfri vattenstråleteknik (WJ) en genomförbar och innovativ metod som kan injicera livskraftiga celler genom visuell guidad cystoskopi i urinrörets sfinkter. I den aktuella studien använde vi WJ för att leverera svin fettvävnadshärledda stromaceller (pADSC) i kadaverisk urinrörsvävnad och undersökte därefter effekten av WJ-leverans på cellutbyte och livskraft. Vi bedömde också de biomekaniska egenskaperna (dvs. elasticitet) genom atomkraftmikroskopi (AFM) mätningar. Vi visade att WJ-levererade pADSC reducerades signifikant i sin cellulära elasticitet. Lönsamheten var signifikant lägre jämfört med kontroller men är fortfarande över 80%.
Introduction
Urininkontinens (UI) är en utbredd sjukdom med en prevalens på 1,8 – 30,5% i europeiska populationer1 och kännetecknas främst av funktionsfel i urinrörets sfinkter. Ur ett kliniskt perspektiv erbjuds kirurgisk behandling ofta till patienter när konservativa terapier eller fysioterapi misslyckas med att ta itu med och lindra de framväxande symtomen.
Cellterapi för potentiell regenerativ reparation av sfinkterkomplexets funktionsfel har uppstått som ett avantgarde-tillvägagångssätt för behandling av UI-patologi 2,3. Dess huvudmål är att ersätta, reparera och återställa den skadade vävnadens biologiska funktionalitet. I djurmodeller för UI har stamcellstransplantation visat lovande resultat i urodynamiska resultat 2,4,5. Stamceller uppstår som optimala cellulära kandidater eftersom de har förmågan att genomgå självförnyelse och multipotent differentiering, vilket hjälper den drabbade vävnadsregenereringen6. Trots den kommande regenerativa potentialen förblir den praktiska användningen av cellterapi hindrad eftersom minimalt invasiv leverans av celler fortfarande står inför flera utmaningar när det gäller injektionsprecision och täckning av målet. Även om det nuvarande tillvägagångssättet som används för cellleverans är injektion genom ett nålsprutasystem7, resulterar det vanligtvis i ett totalt underskott av livskraftiga celler, med rapporterade livskrafter så låga som 1% – 31% efter transplantation8. Dessutom har cellleverans via nålinjektion också visat sig påverka placeringen, retentionshastigheten samt fördelningen av transplanterade celler i den riktade vävnaden 9,10,11. Ett genomförbart, nytt tillvägagångssätt som övervinner ovannämnda begränsning är den nålfria cellleveransen via vattenstråleteknik.
Vattenstråleteknik (WJ) växer fram som ett nytt tillvägagångssätt som möjliggör hög genomströmningsleverans av celler genom cystoskop under visuell kontroll i urinrörets sfinkter 12,13. WJ möjliggör cellleverans vid olika tryck (E = effekter i bar) som sträcker sig från E5 till E8013. I den första fasen appliceras (vävnadspenetrationsfasen) isotonisk lösning med högt tryck (dvs. E60 eller E80) för att lossa den extracellulära matrisen som omger den vävnad som är riktad och öppna små sammankopplade mikro-lacunae. I den andra fasen (injektionsfasen) sänks trycket inom millisekunder (dvs upp till E10) för att försiktigt leverera cellerna till den riktade vävnaden. Efter denna tvåstegsapplikation utsätts cellerna inte för ytterligare tryck mot vävnaden när de matas ut utan flyter i en lågtrycksström till ett vätskefyllt kavernöst område13. I en ex vivo-modellinställning där stamceller injicerades via WJ i kadaverisk urinrörsvävnad kunde livskraftiga celler därefter aspireras och hämtas från vävnaden och expanderas ytterligare in vitro13. Även om en studie från 2020 av Weber et al. visade genomförbarheten och tillämpligheten av WJ för att leverera fotavtrycksfria kardiomyocyter i myokardiet14, måste man komma ihåg att WJ-tekniken fortfarande är i ett prototypstadium.
Följande protokoll beskriver hur man förbereder och märker svin fettvävnadshärledda stromaceller (pADSC) och hur man levererar dem till infångningsvätska och kadavervävnad via WJ-teknik och Williams cystoskopinålar (WN). Efter cellulär injektion bedöms den cellulära vitaliteten och elasticiteten via atomkraftsmikroskopi (AFM). Via steg-för-steg-instruktioner ger protokollet ett tydligt och kortfattat tillvägagångssätt för att skaffa tillförlitliga data. Diskussionsdelen presenterar och beskriver teknikens stora fördelar, begränsningar och framtidsperspektiv. WJ-leveransen av celler samt följderna efter översättningsanalyserna som rapporteras här ersätter standardnålinjektionen och ger en solid cellleveransram för regenerativ läkning av målvävnaden. I våra senaste studier gav vi bevis för att WJ levererade celler mer exakt och åtminstone vid jämförbar livskraft jämfört mednålinjektioner 15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den aktuella studien demonstrerade och presenterade vi ett steg-för-steg-tillvägagångssätt för WJ-cellleveransförfarande och använde en följd av kvantitativa undersökningar för att bedöma effekten av WJ-leverans på cellulära egenskaper: cellulär livskraft och biomekaniska egenskaper (dvs. EM). Efter WJ-injektion var 85,9% av de skördade cellerna livskraftiga. När det gäller WN-injektion behöll 97,2% av cellerna sin livskraft efter injektion. Således uppfyller WJ-metoden ett absolut krav för en klini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar våra medförfattare från de ursprungliga publikationerna för deras hjälp och stöd.
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
