Detta protokoll beskriver en metod för att etablera en human blod-hjärnbarriär (BBB) in vitro-modell . Endotelcellerna och pericyterna är sådda på varje sida av ett insatsfilter (blodfack) och astrocyter sås i bottenbrunnen (hjärnfacket). Den karakteriserade modellen användes för nanopartiklar transportexperiment.
Leveransen av läkemedel till hjärnan är fortfarande en utmaning på grund av blod-hjärnbarriärens (BBB) mycket specifika och restriktiva egenskaper, som styr och begränsar tillgången till hjärnans parenkym. Men med utvecklingen av nanoteknik utvecklades stora paneler av nya nanomaterial för att förbättra läkemedelsleveransen, vilket belyser behovet av tillförlitliga in vitro-mikrosystem för att förutsäga hjärnans penetration inom ramen för prekliniska analyser. Här är en enkel metod för att skapa ett mikrofysiologiskt system för att modellera BBB med enbart mänskliga celler. I sin konfiguration består modellen av en trippelkultur inklusive hjärnliknande endotelceller (BLC), pericyter och astrocyter, de tre huvudsakliga BBB-cellulära aktörerna som är nödvändiga för att inducera och reglera BBB-egenskaperna på ett mer fysiologiskt sätt utan krav på åtdragningsföreningar. Modellen som utvecklats i ett 12-brunnsplattformat, redo efter 6 dagars trippelkultur, kännetecknas av fysikaliska egenskaper, gen- och proteinuttryck och används för polymer nanogeltransportmätning. Modellen kan användas för ett omfattande spektrum av experiment i friska och patologiska tillstånd och utgör ett värdefullt verktyg för prekliniska bedömningar av molekyl- och partikeltransport, samt inter- och intracellulär handel.
BBB, lokaliserad på nivån av hjärnkapillärendotelceller (ECs), kontrollerar och reglerar tillgången till hjärnparenkymen, vilket är avgörande för att upprätthålla hjärnans homeostas och neurala cellers funktion 1,2. Men när det gäller hjärnpatologi representerar bristen på tillgång till hjärnparenkymen ett verkligt hinder för att utveckla terapeutiska strategier.
BBB ECs har en komplex uppsättning egenskaper, inklusive proteiner med tät korsning (TJ), som tätar det intercellulära utrymmet, associerat med ett system av effluxpumpar, specifika transportörer och receptorer, som styr den transcellulära vägen 1,2,3. Dessutom induceras och upprätthålls alla dessa egenskaper tack vare kommunikation med pericyterna inbäddade i BBB EC-källarmembranet och astrocyterna, vars ändfötter omger hjärnkapillärerna 1,2,3. Därför är det en utmaning att studera BBB in vitro med tanke på komplexiteten i dess arkitektur och kommunikationen mellan de olika celltyperna som utgör den neurovaskulära enheten (NVU)2. Dessutom är de olika celltyperna avgörande för induktion och underhåll av BBB-egenskaper och påverkar följaktligen förutsägelsen av korsningen genom BBB. Olika strategier för läkemedelsleverans till hjärnan testades redan med hjälp av en stor panel av taktik för att kringgå BBB-begränsade egenskaper4. På senare tid, med utvecklingen av nanoteknik, utvecklas nya material för applikationer som läkemedelsbärare 5,6. Förutom deras högre belastning, minskad toxicitet och ökade läkemedels biotillgänglighet kan dessa nya nanomaterial funktionaliseras för en trojansk häststrategi för att korsa BBB och specifikt rikta in sig på celler i parenkymen 5,6. Bland de olika typer av nanomaterial som utvärderas har nanogeler väckt stor uppmärksamhet, främst på grund av deras kolloidala egenskaper och förmåga att skräddarsy den kemiska strukturen för att införa stimuliresponsiva egenskaper 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
In vitro-modeller utvecklas nu för prekliniska studier med humana celler för att förutsäga hjärnans penetration av läkemedel16. Olika inställningar av dessa modeller finns tillgängliga, från monolager av hjärn-ECs till flera cellsystem16. Med tanke på vikten av NVU-cellerna i BBB-induktionen och underhållet och det samordnade svaret på den patologiska miljön måste BBB in vitro-modeller överväga alla dessa huvudpersoner för att förbättra relevansen av förutsägelsen 2,17.
Den nuvarande metoden beskriver att man sätter upp en trippelodlings in vitro-modell av den humana BBB, som är fullt utvecklad med mänskliga celler för att studera specifika cellulära och humana molekylära mekanismer. För att vara fysiologiskt relevant består modellen av de tre viktigaste cellulära aktörerna i BBB (ECs, pericyter och astrocyter) som är nödvändiga för att inducera och bibehålla BBB-egenskaperna, utan användning av åtdragningsföreningar och uppvisar en uppsättning egenskaper som krävs för att betraktas som en in vitro BBB-modell16,18. Modellen är uppbyggd i en konfiguration som avgränsar blod- och hjärnfacket, lämplig för prekliniska studier av läkemedels- och partikeltransport för att förutsäga hjärnpenetration. Modellens användbarhet illustreras genom att mäta transporten av polymera nanogeler.
Behandling av hjärnsjukdomar är fortfarande en utmaning med tanke på läkemedlens svårighet att hindra BBB att nå sina cellulära och molekylära mål i hjärnparenkymen.
Läkemedelsutveckling för hjärnsjukdomar uppvisar för närvarande en låg framgångsgrad eftersom de flesta läkemedel som visar lovande resultat i prekliniska modeller inte kunde visa någon nytta när de användes i kliniken. Efter “3R-regeln”, som syftar till att minska antalet djur som används för experiment, utvecklas in vitro-modeller av BBB för att studera hjärnpatologier och för att förutsäga hjärnpenetration av läkemedel29. In vitro-modeller av BBB har huvudsakligen utvecklats med hjälp av djurceller och har blivit mer sofistikerade för att förbättra relevansen av de erhållna resultaten16. Ett av de betydande framstegen i användningen av mänskliga celler, vilket ger obestridlig ny insikt och mer specificitet, på cellulär och molekylär nivå, för att studera mänskliga sjukdomsmekanismer16. Utvecklingen av relevanta modeller kräver dock att man överväger förbättringen av BBB in vitro-modellinställningarna och den kunskap som uppstår tack vare djurmodeller. Därför måste den ta hänsyn till komplexiteten i BBB-arkitekturen och vikten av cell-cellkommunikationen för att studera BBB under fysiologiska och patologiska förhållanden30.
Protokollet som presenteras här beskriver en metod för att inrätta en fullständig human BBB in vitro-modell som omfattar de tre huvudcelltyperna i BBB, utan begränsning av tillgången till hjärnvävnad. Som ett flercellssystem är induktionen och upprätthållandet av BBB-egenskaper, utan artificiell användning av åtdragningsföreningar, utan istället inducerad av cell-cellkommunikation, mer fysiologiskt relevant och i linje med in vivo-induktionen av BBB-egenskaperna31. Därför är respekten för protokollets kronologi av största vikt för protokollets framgång. Dessutom representerar inkubationstiderna under inställningen av trippelkulturen och när de tre celltyperna är monterade de viktigaste kritiska stegen i protokollet.
BBB-egenskaperna i ECs induceras av samkulturen med pericyter, som beskrivs för samkulturmodellen24. Därför är kulturen av pericyter på baksidan av skärfiltret den mest kritiska punkten och kräver strikt att protokollet följs med risk för att inte ha tillräckligt med pericyter för induktion av BBB-egenskaperna. Först och främst, under beläggningsförfarandet och även cellsådd, måste man vara uppmärksam på att inte ha locket på petriskålen i kontakt med beläggningen och även mediet när cellerna är sådda för att säkerställa en bra beläggning av filtret och inte förlora celler (steg 2.2.1 och 2.2.4). När pericyterna är sådda är det dessutom viktigt att vänta den angivna tiden för fastsättning av pericyterna (steg 2.2.4) innan man återställer insatsfiltret för beläggning och sådd av ECs på andra sidan (steg 2.2.5 och 2.3). När de är sådda krävs sex dagar för att inducera BBB-egenskaperna genom cell-cellkommunikation (steg 2.4).
Modellen valideras i termer av begränsad permeabilitet (associerad med inställningen av de snäva korsningarna) eftersom ECs i trippelkulturmodellen visar permeabilitetsvärden för BBB-integritetsmarkörer som liknar den validerade samodlingsmodellen och även mäts i validerade djur- eller människomodeller 16,27,32. Dessutom kräver valideringen av en in vitro BBB-modell, förutom den begränsade permeabiliteten, lyhördhet för andra celltyper i NVU och uttryck av funktionella receptorer och transportörer16. Dessutom är modellen reproducerbar och producerar flera skärfilter och brunnar för att utföra många analyser (gen- och proteinuttryck, fluorescerande färgning, toxicitetstester) på varje celltyp separat utan att kräva en cellsorteringsmetod.
Modellen utvecklades med hjälp av ett 0,4 μm porstorleksfilter för att ha en celltyp på varje sida av insatsfiltret. Insatsfiltersystemet möjliggjorde studier av cell-cellkommunikation under fysiologiska förhållanden genom att överföra det vid välinnehållande astrocyter. Förekomsten av astrocyter i systemet representerar ett plusvärde jämfört med den initiala samkulturen in vitro-modell 24. Med tanke på vikten av astrocyter i BBB: s fysiologi möjliggör denna tredje celltyp ytterligare förståelse för cellcellkommunikationen inom BBB. Dessutom kan trippelcellodlingssystemet också studeras vid patologiska tillstånd såsom stroke, där astrocyterna spelar en viktig roll33,34,35. Dessutom kan utformningen av BLC/ pericyter på båda sidor av insatsfiltret enkelt placeras på andra celltyper för att efterlikna patologiska tillstånd som hjärncancer23.
Inläggsfiltrets porstorlek kan medföra begränsningar med vissa experiment, till exempel celltransmigration över BBB. Utvecklingen av modellen med en större porstorlek kräver emellertid anpassning av protokollet för att säkerställa bildandet av ett fysiologiskt monolager av ECs och inte flera lager, vilket inte är fysiologiskt relevant för att efterlikna BBB36.
Modellens tillämplighet har demonstrerats med hjälp av NGs transportexperiment som visar möjligheten att göra transportexperiment med hjälp av ett flercelligt system. Ändå bör man vara medveten om svårigheterna med att ha en kontrollförening eller molekyl för transportexperimentet och dela jämförbara egenskaper med NG eftersom varje nanostruktur uppvisar en unik uppsättning egenskaper (molekylvikt, laddning, form, fysikaliska egenskaper, proteinkoronabildning).
En begränsning av modellen är frånvaron av skjuvspänning, vilket visade sig påverka differentieringen av ECs och uttrycket av TJ-proteiner37. Att utveckla ett fluidiskt system som efterliknar hjärnkapillären är dock utmanande med tanke på komplexiteten i att lägga till en flytande del, som kräver en specifik enhet, i ett flercellssystem. Dessutom är den specifika produkten vanligtvis inte kommersiellt tillgänglig och tillåter inte många replikat, vilket gör fluidiska system mindre anpassade för användning med hög genomströmning.
Sammanfattningsvis reproducerar detta trippelodlingssystem bestående av mänskliga celler in vitro BBB: s arkitektur. Det möjliggör generering av många insatser som kan användas för omfattande screening av föreningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete beviljas av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 764958, som en del av NANOSTEM-projektet, ett Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Denna studie beviljas av “Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais” (Fellowship to Clémence Deligne), “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent” (SFCE), föreningen “l’étoile de Martin” och föreningen “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |