CD1-möss av vildtyp inhystes enligt europeiska bestämmelser, med en vanlig dag- och nattcykel med mat och vatten ad libitum. CD1-honor parades med CD1-hanar över natten och vaginala pluggar kontrollerades på morgonen (E0.3). Endast gravida kvinnor användes för injektionen. Etiskt godkännande för alla försök som beskrivs här beviljades av Jordbruksverket. 1. Beredning av glasnålar: nåldragning och slipning OBS: Även om förgrundsnålar kan köpas, möjliggör dragnålar internt enkla justeringar av nållängd, borrning och avfasningsvinkel. Montera en glaskapillär i mikropipetten/kapillärdragaren. Använd följande inställningar med den angivna utrustningen (se materialförteckningen): värm 580 enheter; hastighet 140 enheter; tid 200 enheter; tryck 500-800 enheter.OBS: Enheterna för olika parametrar definieras av kapillärdragaren. Enheter kan variera för olika utrustningar. Tryck på Dra för att dra isär kapillären och producera två glaskapillärer med avsmalnande ändar.OBS: Efter dragning smälts spetsarna på de två glaskapillärerna på grund av mikropipettdragarens höga temperatur. Skär spetsen med kirurgisk sax för att få en nållängd på ~ 7 mm (mätt från vilken nålen börjar avsmalna) (figur 1A).OBS: För E7.5-injektioner är en lång och fin nål avgörande eftersom injektionsområdet är mycket litet och känsligt. Korta och vidsträckta nålar kommer att leda till embryonala dödsfall. Slipa den skurna nålspetsen för att skapa en skarp avfasning (figur 1C-F).Slipa nålen i en vinkel på 20° vid maximal hastighet i minst 30-45 min.OBS: Ultrarent vatten tillsätts till slipplattan för att fungera som smörjmedel, minska friktion / temperatur och tvätta bort glaspartiklar (figur 1B). Överskott av vätska kan dock sakta ner kvarnen. Se till att nålspetsen (figur 1C) vidrör slipplattans yta (figur 1D) men inte böjer sig (figur 1E).OBS: Böjd slipning resulterar i en lång och ömtålig nålspets med fel avfasningsvinkel, som lätt kan gå sönder under injektionen. Brytande nålar kan skada embryot och måste ersättas med en intakt nål. En korrekt jordspets visas i figur 1F,G. Efter slipning förväntas den resulterande nålborrningen ha en innerdiameter (ID) på ~ 15 μm och en ytterdiameter (OD) på ~ 35 μm (figur 1G). Fyll en 1 ml spruta med mineralolja och fäst en 27 G nål. Ta bort nålskyddet och sätt in sprutnålen i den nymalda glaskapillären. Injicera mineralolja tills olja droppar från kapillärspetsen. Fortsätt injicera medan du drar tillbaka 27 G-nålen tills kapillärnålen är fylld med mineralolja, varefter sprutnålen kan tas bort. Förvara malda och mineraloljefyllda nålar i en sluten miljö för att förhindra skador och dammansamling. För förvaring, sätt in två rullar modelleringslera i en vanlig petriskål för att fungera som hållare (figur 1H). Sätt försiktigt nålarna på leran och placera dem långt ifrån varandra för enkel hämtning av nålarna.OBS: Eftersom nålberedning är tidskrävande är det bäst att förbereda nålar minst en dag före injektioner. Kassera nålarna efter högst två kullar eftersom de blir trubbiga. Förbered alltid reservnålar vid nålskador under beredning eller injektion. Figur 1: Nålförberedelse för E7.5 fosterhålighetsinjektioner. (A) Representativa exempel på en dragen men oskuren glaskapillärnål (vänster), en kapillärnål skuren i optimal längd för E7.5-injektioner (mitten) och en kapillärskuren för kort (höger). (B) Kvarnen med enhetlig täckning av vatten, som är klar för nålslipning. (C-F) Representativa exempel på olika nålspetsar. (C) Skuren men ojordad nålspets monterad i kvarn; (D) idealiskt slipläge med nålspetsen som bara vidrör kvarnen; E) nålen sänks för långt och böjs under malningsprocessen, (F) en idealisk slipad nålspets för E7.5 AC-injektioner. (G) En slipad nålspets som visar borrningen med en innerdiameter på ~ 15 μm och en ytterdiameter på ~ 35 μm, vilket är lämpligt för E7.5 AC-injektion. Nålborrningen visas som streckade linjer. Ytterdiameter betecknad med röda pilspetsar; innerdiameter betecknad med blå pilspetsar. (H) Nålförvaring: Petriskål fylld med dragna och slipade nålar. Två rader modelleringslera fungerar som hållare. OBS: För den okulära mikrometern i C, F, G, 1 cm är uppdelad i 100 platser; målet är 3x; Därför 1 tonhöjd= 10 000 μm/(100 × 3) ≈ 33,4 μm. Förkortningar: AC = fosterhålan; ID = inre diameter; OD = ytterdiameter. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 2. Dag före injektion: förbered bänk för ultraljudsverifiering av graviditet OBS: Allt arbete ska utföras i en ventilerad biosäkerhetsnivå 2 (BSL 2) bänk vid arbete med lentivirus. Ultraljudsverifiering av graviditet kan utföras på en ventilerad bänk. Slå på ultraljudsmaskinen, värmebordet och O2-tillförseln för isofluranpumpen (kan variera mellan utrustning).OBS: Kontrollera isofluransystemet för att säkerställa att inget isofluranläckage i luften. Placera en tom avfallspåse (tejpad på innerväggen för enkel åtkomst), hårborttagningskräm, sterila packade bomullspinne, vatten, silkespapper och kirurgisk tejp inuti BSL 2-bänken. Förbered fyra bitar kirurgisk tejp (~ 7 cm lång) för att säkra musbenen under ultraljudskontrollen av graviditeten. 3. Ultraljudskontroll för att bekräfta graviditeten OBS: Detta steg kan utföras dagen före E7.5 Injektioner, vid E6.5. Se diskussionen för detaljer om kontrollen av graviditetsålder. Placera den tidsparade honmusen i induktionskammaren. Slå på gasflödet med ett syreflöde på ~ 2,1 LPM och en initial dos på 3-4% isofluran för att inducera anestesi. Kontrollera att honan är helt bedövad genom att kontrollera tassreflexen. Om tassreflexen är frånvarande, sänk isofluran till 1,5-2%.OBS: Det tar cirka 3 minuter att inducera anestesi. Byt gasflödet från induktionskammaren till värmebordets näskon. Placera den bedövade kvinnan i ryggläge (buken uppåt) på värmebordet och placera nosen i den bifogade näskonen för att säkerställa underhåll av anestesi under ultraljudskontrollen av graviditeten. Fäst alla fyra tassarna på bordet med de förberedda bitarna av kirurgisk tejp utan att sträcka kvinnans kropp eller fånga whiskersna. Applicera en ärtstor mängd hårborttagningskräm på underlivet. Använd en bomullspinne och fördela krämen över underlivet (en kvadrat på ~ 3 x 3 cm) och massera försiktigt in den genom att rulla bomullspinnen fram och tillbaka. När pälsen börjar lossna från huden, fukta ett silkespapper och ta bort grädden och pälsen. Rengör det avpälsade området med fuktigt silkespapper tills all kräm och hår är borta. Torka huden. Applicera en plommonstorlek av ultraljudsgel på det rakade området och fortsätt att identifiera livmodern med ultraljud med någon av följande tre metoder.För att göra detta manuellt, håll ultraljudssonden i ultraljudsgelén och flytta sonden för att hitta livmodern. För halvmanuell inflygning #1, placera ultraljudssonden (fäst vid räckessystemet) ovanför honbuken genom att lossa och flytta en del av skenan längs x-planet. Sänk ultraljudssonden i gelén (z-planet) och skanna genom underlivet (y-planet) (figur 2A). För halvmanuell tillvägagångssätt #2, sänk ultraljudssonden (fäst vid räckessystemet) i gelén för att avbilda underlivet. Håll ultraljudssonden stillastående under processen och flytta värmebordet med de bifogade hjulen längs x- och / eller y-plan (figur 2B).OBS: I dessa tidiga embryonala stadier kan inre organ, t.ex. tarmen, se ut som livmodern vid ultraljudsavbildning. Men medan embryon och decidua framträder som en sekvens av sfärer (liknande pärlor längs ett halsband), har tarmen utseendet av ett kontinuerligt rör. Anslutningen av luminala utrymmen (separata sfärer kontra ett kontinuerligt rör) kan bedömas genom att skanna fram och tillbaka genom strukturen av intresse för att avgöra om strukturen är en diskret sfär (embryo / decidua) (figur 2C) eller ett kontinuerligt rör (tarm) (figur 2D). I detta skede är det inte nödvändigt att registrera antalet embryon; det är tillräckligt att bekräfta deras närvaro eller frånvaro. När graviditetsstatusen är bestämd, lyft ultraljudssonden bort från buken och torka av underlivet med fuktigt silkespapper för att ta bort ultraljudsgelén. Stäng av isofluranpumpen och ta bort operationstejpen för att släppa tassarna. Placera honan i utsatt position (magen nedåt) i en ren bur på en 40 °C värmeplatta. Håll kvinnan under noggrann observation tills hon återfår medvetandet, vilket tar 2-6 min.OBS: Se till att ultraljudskontrollen för en kvinna är <10 min för att minimera exponeringen för isofluran. Ta bort allt material och avfall och rengör alla ytor med 70% etanol. Torka av eventuell kvarvarande ultraljudsgel från ultraljudssonden med en torr, mjuk och luddfri pappersvävnad. Stäng av ultraljudsmaskinen, ventilerad bänk / BSL2-bänk, värmebord och O2-tillförsel . 4. Ultraljudskontroll för embryo iscensättning OBS: Detta steg utförs före operationen och tjänar till att stratifiera de gravida kvinnorna enligt deras AC-storlekar. Detta steg är avgörande vid E7.5 när målet är att rikta in sig på det utvecklande CNS. Vid detta tidiga utvecklingsstadium påverkar en skillnad på några timmar i utveckling signifikant storleken på AC och utvecklingen av neurulering. Bedöva den första gravida kvinnliga musen som följer stegen i steg 3.1-3.5. Placera och fixera honan på bordet enligt beskrivningen i steg 3.6. Applicera en plommonstorlek av ultraljudsgel på den rakade buken och sänk ultraljudssonden för att avbilda kvinnans underliv.OBS: Detta steg förutsätter att honan inspekterades med ultraljud föregående dag för graviditet och redan har tagit bort päls på buken. Om så inte är fallet måste pälsen avlägsnas före tillsats av ultraljudsgel enligt steg 3.7-3.8. Vid E7.5 är livmodern och deciduas större och lättare att skilja från inre organ. Dessutom är AC större och kan särskiljas från det exocelomiska hålrummet (ExC). Skanna genom vänster och höger livmoderhorn så fullständigt som möjligt.OBS: Vissa embryon ligger djupare inuti kvinnans kropp och kan missas. Spela in embryonas antal och stadier. Notera antalet fosterhålor i idealstorlek, acceptabla håligheter och deciduas utan hålighet (figur 2E-G). Iscensätt alla graviditeter och rangordna dem därefter. Injicera kvinnor med en majoritet av AC i idealstorlek omedelbart efter ultraljudskontrollen (steg 4.4) enligt instruktionerna i steg 4.5-4.7. För kvinnor med en majoritet av acceptabla (där de exocelomiska och fosterhålorna ännu inte är tydligt uppdelade i två hålrum) eller frånvarande håligheter, skjut upp injektionen och iscensätt dem igen efter ett par timmar. Om de flesta håligheterna fortfarande är för små, skjut upp injektionerna med 10-12 timmar. Figur 2: Inspektion och iscensättning av fosterhålor under ultraljudskontroll. (A) Översikt över järnvägssystemet med bifogad ultraljudssond, nanoinjektor och värmebord. Ultraljudssonden kan flyttas i x-, y- och z-plan för att uppnå optimal anpassning till honans buk eller AC. (B) Värmebordet kan flyttas via två hjul i x- och / eller y-plan för att möjliggöra exakt skanning och bedömning av AC: erna, medan ultraljudssonden kan förbli statisk. (C) Representativa ultraljudsbilder av E6.5-deciduas inuti honans buk under ultraljudskontroll för att bekräfta graviditet (vita prickade konturer). Inga håligheter har bildats vid denna tidpunkt; Ibland är emellertid ektoplacentalkonen (vita asterisker) synlig. Deciduas kan kännas igen av sin sfäriska form och särskiljas från tarmen, som framträder som ett kontinuerligt rör. (D) Representativ bildsekvens av tunntarmen (vitnade prickade konturer), som är kontinuerlig vid skanning genom underlivet. (E-G) Representativa ultraljudsbilder under hålrumsuppsättning före E7.5-injektioner. De foster- och exocelomiska håligheterna har bildats och separeras av amnionen. Ectoplacentalkonen fungerar som huvudblodtillförsel och framträder som en ljuspunkt i ultraljudet. AC är mest distal från ectoplacental kon. (E) Idealstora AC verkar större än det exocelomiska hålrummet, medan medelstora håligheter verkar mindre (F). Om inga håligheter är synliga (G) betyder det antingen att embryot är resorberat eller inte har nått E7.5 ännu. Skalstänger = 1 mm. Förkortningar: A = Amnion; AC = fosterhålan; ExC = exocelomisk hålighet; EC = Ectoplacental kon. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 5. Injektionsdag: förbered BSL2-bänken för operation Limma ett stycke elastiskt membran på den runda, centrala öppningen av en kommersiellt tillgänglig, modifierad petriskål. Se till att membranet är väl fastsatt på petriskålen för att förhindra läckage.OBS: Om skålen blir läckande eller inte är vällimmad kan kanterna på det elastiska membranet säkras ytterligare med silvertejp. Gör ett 1-1,5 cm långt snitt i mitten av det elastiska membranet. Slå på ultraljudsmaskinen, BSL2-bänken, värmeplattan,O2-tillförseln för isofluranpumpen och glaspärlsterilisatorn (inställd på 300 °C). Inuti BSL2-bänken, placera en tom avfallspåse (tejpad på innerväggen för enkel åtkomst); sterila förpackade bomullspinnar (använd en ny för varje operation / varje kvinna); kirurgiska verktyg (sax, pincett, klämmor, sutur) och kirurgisk tejp; en hel flaska rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS), en tom flaska för insamling av avfall och en 25 ml pipett; en petriskål med elastiskt membran för operation; locket på petriskålen med en 2 x 2-3 x 3 cm bit parafilm fäst vid locket med en droppe vatten; modelleringslera: 4 större bollar eller kuber (~ 3 x 3 x 3 cm3) och en cylindrisk bit (~ 4 x 1 cm); en spruta med smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin, 0,05-0,1 mg/kg kroppsvikt) och ögongelOBS: Bollarna (eller kuberna) av modelleringslera kommer att fungera som “fötter” eller stativ/hållare för petriskålen när skålen har placerats ovanpå kvinnans buk. Den cylindriska biten av lera säkrar embryona inuti skålen. Om mer än en lösning injiceras, eller om nålen behöver fyllas på under injektionerna, kan samma bit parafilm användas om lösningarna kan placeras isär. 6. Nålladdning Torka bort överflödig mineralolja med silkespapper för ett bättre grepp.OBS: Rengör alltid från spetsen för att förhindra skador eller personskador. Se till att alla komponenter (en tätande O-ring, en distans och en främre packning – alla inrymda under hylsan, figur 3A) är installerade i rätt riktning (figur 3B, hylsa borttagen för visualisering) för att hålla kapillärnålen på plats och skapa en lufttät anslutning, så att bubbelbildning undviks när du går fram eller drar tillbaka metallkolven inuti nålen. Se till att nanoinjektorns metallkolv är helt indragen. Kontrollera genom att trycka på Fyll och vänta på ett dubbelt pip som indikerar att kolven är helt indragen. Med hylsan fäst men något lossad (skruvad 45-90 grader), skjut glasnålen på metallkolven och tryck kapillärnålen tillsammans med metallkolven genom den främre packningen tills den når distansen (figur 3C, D, hylsa borttagen för visualisering).OBS: Visst motstånd visas när kolven passerar genom packningen och minskar när den når distansen. Se till att kapillärnålen är ordentligt insatt i distansen för att skapa en lufttät anslutning (figur 3D). Säkra nålen genom att dra åt hylsan på nanoinjektorn (skruva fast ordentligt).OBS: Dra inte åt för hårt eftersom det kan krossa nålen. Tryck på Tom för att trycka in kolven i nålen och släpp ut oljan från nålspetsen. Om glasnålen rör sig, dra tillbaka kolven, ta bort nålen och ladda om. Om detta får luftbubblor att bildas, ta bort nålen och fyll på med mineralolja.OBS: En ordentligt säkrad nål ska inte röra sig med kolven. Placera en droppe av viruset (~ 6 μl) eller annan injektionslösning på en bit parafilm1 (figur 3E; Evans blå färgämne används för visualiseringsändamål).OBS: Den maximala volymen av nanoinjektorn är ~ 5 μL. Tryck på Fyll för att skapa en luftbubbla som ska fungera som en avdelare mellan oljan och lösningen (figur 3F).OBS: Detta fungerar också som en positioneringsmarkör när du fyller eller tömmer nålen. Sänk nålen, sänk ned spetsen i lösningen och tryck på Fyll (bild 3F,G). Titta på vätskenivån när lösningen laddas efter luftbubblan. Tryck på Töm för att driva ut täppan och ladda om genom att trycka på Fyll om luftbubblan blir långsträckt utan att vätskan kommer in i nålen. Om detta inte löser problemet, byt nålen. När nålen är fullastad (figur 3H), lyft nålen i z-planet och aspirera en liten volym luft vid spetsen för att förhindra avdunstning av lösningen vid nålspetsen och igensättning av nålen. Vrid nanoinjektorn med den fästa nålen bort från operatören, mot baksidan av bänken, för att förhindra oavsiktlig skada eller personskada. Figur 3: Fäst nålen på nanoinjektorn och lösningsbelastningen. A) Startläge innan nålen monteras på nanoinjektorn: metallkolven är helt indragen och spännhylsan fäst. (B) Under hylsan visas alla tre komponenterna för att hålla och säkra nålen i rätt ordning (från vänster till höger): tätning av O-ring (tunn och svart), distans (vit), O-ring (svart) med stort hål (som nålen måste passera genom). För att säkerställa en lufttät anslutning skjuts glasnålen över metallkolven (C) och skjuts genom öppningen på den främre O-ringen tills den når distansen (D). (E-H) Laddning av lösningen i nålen. (E) En droppe lösning placeras på en bit parafilm på ett plattlock. (F) Skapa en luftbubbla genom att trycka på Fyll innan du laddar lösningen och sänk ned nålspetsen i lösningen. (G) Lösningen laddas i nålen. (H) Lösningen laddas i nålen. OBS: Hylsan har tagits bort i (B-D) för visualisering men bör förbli fäst under experiment. Det sista steget att säkra nålen är att dra åt hylsan. Evans blå färgämne används för visualisering i E-H. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 7. Injektioner OBS: Alla instrument som används i denna procedur steriliseras före operationen och mellan varje mus. Bedöva den första honan med håligheter i idealstorlek (se avsnitt 4). Placera och fixera honan på bordet, enligt beskrivningen i steg 3.1-3.6. Applicera ögongel på ögonen för att förhindra uttorkning av hornhinnan och injicera smärtstillande medel subkutant.OBS: Rekommenderade smärtstillande medel: Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvikt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller liknande i enlighet med lokala djurskyddsbestämmelser. Multimodal perioperativ analgesi upprätthålls med injicerade analgetika och isofluran. Förbered underlivet aseptiskt genom att torka av med en trasa indränkt med 0,5 mg/ ml klorhexidinlösning (eller liknande) och torka huden. Använd kirurgisk sax för att göra ett 1,5-2,0 cm vertikalt mittlinjesnitt i underlivet.OBS: Förbered operationsområdet enligt lokalt godkända desinfektionsrutiner. Lyft huden försiktigt och frigör huden från det underliggande muskelskiktet, cirka 1 cm runt snittpunkten, för att underlätta suturering efter operationen. Gör ett 1 cm vertikalt mittlinjesnitt i muskelskiktet. Med ett par pincett, lyft ena sidan av huden och muskelskiktet och med det andra paret, leta efter livmoderhornen.OBS: Deciduas är ordnade som pärlor på ett halsband, medan tarmen är ett långt, kontinuerligt rör (figur 4A). Med pincett, dra försiktigt ut båda livmoderhornen från buken. Håll vävnaden mellan embryon; Pressa dem inte direkt (figur 4B).OBS: Livmodern är fäst vid kroppen vid livmoderhalsen, och de två äggstockarna/äggledarna fästs via ligament. Dra inte i/lossa livmodern från dessa ankarpunkter. Räkna och notera antalet embryon på vänster och höger sida. Numrera embryona antingen från äggstocken till livmoderhalsen eller från livmoderhalsen till äggstocken.OBS: Detta är särskilt viktigt om injicerade embryon kommer att samlas in i embryonala stadier. Tryck försiktigt tillbaka alla embryon i bukhålan med en fuktig bomullspinne, utom de tre första som ska injiceras. Placera en droppe PBS på elastiken i petriskålen och håll den omedelbart ovanför embryona. Sätt in slutna pincett i resårens snitt och släpp tången för att öppna det elastiska snittet så att vätskan faller på embryona.OBS: Detta säkerställer rehydrering av embryona och att det elastiska membranet fäster vid kvinnans våta hud, vilket förhindrar läckage av PBS i nästa steg. Dra en del av livmodern, som motsvarar tre embryon, genom elastiken med pincett och sätt försiktigt petriskålen på kvinnans buk. Med pincetten och en fuktig bomullspinne, justera livmoderns positionering och elastiken för att säkerställa att elastiken är förseglad mot kvinnans hud för att förhindra PBS-läckage. Använd de fyra lerfötterna för att säkra och fästa petriskålen omedelbart ovanför buken, vilket minskar trycket på honan och känsligheten för avbildning för andning och hjärtslag hos honan. Tryck ner modelleringslercylindern till höger om embryona/livmodern för att fixera livmodern (figur 4C).OBS: Denna orienteringsinstruktion förutsätter att nålen är till vänster om honan och att embryona i kvinnans vänstra livmoderhorn exponeras. Sidan av livmodern (vänster eller höger livmoderhorn) är avgörande eftersom AC antingen vetter mot nålen (vänster horn; Figur 4D) eller vetter mot den stabiliserande lercylindern (höger horn; Figur 4E). För att injicera embryon från det högra livmoderhornet, placera lercylindern på vänster sida av embryona (figur 4F) och vrid värmebordet 180 ° (figur 4G) för att uppnå rätt orientering. Om nålen kan flyttas istället, anpassa efter behov för relevant installation. Tillsätt PBS i petriskålen tills embryon och livmoder är täckta med PBS. Sänk ner ultraljudssonden i PBS och justera musen / operationsbordet så att det första embryot är i linje med ultraljudssonden för att underlätta inspelningen av injektionerna.OBS: “Första” avser numreringen av embryon från äggstocken till livmoderhalsen. Skanna igenom alla tre embryona och inspektera AC: erna. Bestäm injektionsvolymen enligt följande:Mät AC: s diameter med ultraljudsmaskinen. Injicera 69 nL om AC-diametern är ≤0,2 mm; injicera 2 x 69 nL (= 138 nL) om AC-diametern är >0,2 mm och ≤0,29 mm; och injicera 3 x 69 nL (= 207 nL) om växelströmsdiametern > 0,29 mm (figur 4H).OBS: Tidigare experiment har visat att upp till 207 nL injektionsvolymer tolereras väl vid E7.515. Framgångsrika injektioner med minimal inverkan på överlevnaden uppnås när den relativa volymökningen av AC inte överstiger 90. Variation i AC-storlek mellan kullkamrater eller musstammar är vanligt och kan kräva ytterligare optimering. Ställ in injektionsvolymerna med injektionsregulatorn. Ställ in injektionshastigheten på att sakta ner med en injektionshastighet på 23 nL/s.OBS: Olika utrustningsmodeller kan resultera i olika injektionskrafter. Sänk nålen i PBS med hjälp av huvudhjulen på skensystemet (x- och z-plan, figur 4I) och tryck på Töm på nanoinjektorregulatorn tills vätskan når nålspetsen.OBS: Om nålen har täppts till kan du trycka på Tom för att lösa upp täppan och / eller ta ut täppan. Lyft ut nålen ur PBS och tryck på Inject. Kontrollera att en droppe av den ungefärliga önskade volymen är urladdad. Sänk nålen i PBS och rikta in den med ultraljudssonden och embryot genom att flytta nanoinjektorn med y-planethjulet på mikromanipulatorn (figur 4J).OBS: Nålspetsen är perfekt inriktad när den visas som en ljuspunkt på ultraljudsbilden (figur 4K, L). Nålen kan flyttas i alla tre riktningsplanen med mikromanipulatorn. Justera nålvinkeln med insprutningsvinkelhjulet för att säkerställa en nästan vinkelrät injektionsvinkel i förhållande till livmoderväggen. För in nålen i AC i en rörelse med hjälp av injektionshjulet på mikromanipulatorn (figur 4J-M). Håll ett öga på nålspetsens ljusstyrka. Om nålspetsen försvinner från ultraljudsbilden, flytta ultraljudssonden framåt eller bakåt för att få nålen tillbaka i fokus.OBS: När nålen är inne i AC kan mindre ändringar av nålens position och fokus göras utan att skada embryot (justeringar inom ~ 0,3 mm). Justera inte nålens position mer än så här. Tryck på Inject (för 207 nL, ställ in volymen på 69 nL och injicera tre gånger). Efter injektion, vänta ytterligare 5-10 s innan du drar tillbaka nålen i en mild rörelse. Figur 4: Optimal storlek och orientering av fosterhålan för framgångsrika injektioner. (A) Livmoderhorn med flera E7,5 deciduas, formade som en sträng av sfärer (botten) jämfört med tjocktarmen (överst). (B) Ta tag i livmodervävnad (vita prickade linjer) mellan deciduas. Undvik att klämma på deciduas (vita pilspetsar) direkt med pincett eftersom deciduas och utvecklande embryon är bräckliga i detta tidiga skede och benägna att resorption vid överdriven yttre kraft. (C) Hona i liggande position med deciduas exponerade i en petriskål fylld med PBS och monterad på fyra fot modelleringslera. Deceduas stabiliseras av ytterligare en bit modelleringslera, formad som en cylinder. (D, E) Orienteringen av AC påverkas av sidan av livmoderhornet som exponeras. Om deciduas från vänster livmoderhorn används, kommer AC att vända bort från lerstabilisatorn och kommer att vara lättillgänglig för nålen till vänster (D). Men om rätt livmoderhorn används kommer ectoplacentalkonen istället att vända mot nålen, vilket gör det svårare att komma åt AC (E). Därför, när du injicerar i rätt livmoderhorn, placeras lerstabilisatorn mot den nålvända sidan (F) och hela värmebordet roteras 180 ° (G). (H) Rekommenderade injektionsvolymer enligt AC-storlekar. I allmänhet kan hålrum med en diameter ≤ 0,2 mm injiceras med högst 69 nL. Diametrar > 0,2 mm och ≤ 0,29 mm tolererar volymer upp till 2 x 69 nL (138 nL) och håligheter > 0,29 mm kan injiceras med 3 x 69 nL (207 nL). Skalstänger = 1 mm. (I, J) Nanoinjektor är fäst vid skensystemet och kan flyttas i x- och/eller z-plan. Nålens vinkel kan justeras med insprutningsvinkelhjulet . (K, L) Nålspetsen (vit pilspets) är i linje med AC när den ser ljusast ut i ultraljudet (L). (M) Ultraljudsbild som visar injektionsprocessen, där nålspetsen är i AC och väl inriktad (vit pilspets). Förkortningar: A = Amnion; AC = fosterhålan; ExC = exocelomisk hålighet; EC = Ectoplacental kon. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Flytta scenen till nästa embryo och upprepa steg 7.22-7.26 för de andra två embryona om de har lämpliga AC-storlekar. Lyft ultraljudssonden och nålen ur PBS med hjälp av mikromanipulatorn. Vrid nålen bort från operatören för att undvika skador och personskador. Med pincett, rikta 1: a och 2:a embryon tillbaka i kvinnans buk genom att försiktigt trycka dem genom elastiken. Ta försiktigt tag i vävnaden intill det 3: e embryot och dra livmodern mot den övre änden av det elastiska snittet. Dra försiktigt upp de 4: e-6: e embryona med pincett och låt det 3:e embryot komma in i buken igen.OBS: Detta steg kan göras utan att ändra PBS eller ta bort petriskålen. Upprepa vid behov tills alla embryon med optimala AC har injicerats eller tidsgränsen har uppnåtts. Tryck försiktigt tillbaka embryona/livmodern i buken på honan. Aspirera PBS och ta bort petriskålen. Om ett virus har använts, hantera som smittsamt avfall. Sy ihop det muskulösa skiktet med Vicryl (USP 6-0, nållängd 13 mm, 3/8 cirkel) i enkla kontinuerliga eller avbrutna suturer och stäng huden med 1-2 klämmor (se materialtabellen). Stäng av isofluranpumpen. Ta bort operationstejpen och placera honan i utsatt läge (magen nedåt) i en ren bur på en 40 °C värmeplatta.OBS: Honan förväntas återfå medvetandet och vara rörlig inom 10 minuter. Se till att proceduren är klar inom 30 minuter. Den genetiska bakgrunden, åldern och vikten hos honan kan påverka känsligheten för anestesi. Övervaka mössen under operationen för tecken på långsam andning (långsam andning betyder att anestesi är för djup) eller rörelse (anestesi är för lätt). Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvikt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller liknande i enlighet med lokala djurskyddsbestämmelser, kan tillhandahållas 8 timmar efter den första injektionen vid behov. Om en annan kvinna ska injiceras, förbered det kirurgiska området medan du övervakar uppvaknandet av den första.Torka av de kirurgiska verktygen med 70% etanol för att ta bort kvarvarande blod eller vävnad och sterilisera dem i den förvärmda glaspärlsterilisatorn i 10 s. Kassera bomullspinnarna och använt silkespapper. Torka av petriskålen och lerbitarna torra med silkespapper. Upprepa steg 7.1-7.35 tills alla honor har injicerats. Töm och kassera nålen.Om det finns ett virus eller en injektionslösning kvar i nålen, tryck på Töm på nanoinjektorn och töm nålens innehåll på silkespapper. Dra tillbaka metallkolven helt genom att trycka på Fyll tills det kommer ett dubbelt pip från regulatorn, vilket indikerar att kolven är helt indragen. Lossa hylsan och skjut nålen av metallkolven. Kasta nålen i avfallsbehållaren för vassa föremål. Rengör BSL-2-bänken.Om ett virus användes, spraya hela operationsfältet med desinfektionsmedel (se materialtabellen). Torka av desinfektionsmedlet efter 15 minuter och rengör hela operationsfältet med 70% etanol. Om inget virus användes, rengör alla ytor med 70% etanol. Torka av eventuell återstående PBS från ultraljudssonden med torrt, mjukt och luddfritt silkespapper. Kassera avfall enligt riktlinjerna för biosäkerhet. Stäng av ultraljudsmaskinen, värmebordet, BSL2-bänken ochO2-tillförseln .