Ex Vivo Hepatisk perfusion genom portalvenen i musen
Summary
Protokollet beskriver en enkel metod för att resektionera en intakt muslever för metaboliska studier genom portalvenperfusion.
Abstract
Metabola sjukdomar som diabetes, pre-diabetes, alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) och alkoholfri steatohepatit (NASH) blir allt vanligare. Ex vivo leverperfusioner möjliggör en omfattande analys av levermetabolism med hjälp av kärnmagnetisk resonans (NMR), under näringsförhållanden som kan kontrolleras noggrant. Eftersom silico-simuleringar förblir ett primärt teoretiskt sätt att bedöma hormonåtgärder och effekterna av farmaceutisk intervention, är den perfuserade levern fortfarande en av de mest värdefulla testbäddarna för att förstå levermetabolism. Eftersom dessa studier vägleder grundläggande insikter i leverfysiologi måste resultaten vara korrekta och reproducerbara. Den största faktorn i reproducerbarheten av ex vivo leverperfusion är kvaliteten på operationen. Därför har vi introducerat en organiserad och strömlinjeformad metod för att utföra ex vivo musleverperfusioner i samband med in situ NMR-experiment. Vi beskriver också en unik tillämpning och diskuterar vanliga problem som uppstår i dessa studier. Det övergripande syftet är att ge en okomplicerad guide till en teknik som vi har förfinat under flera år som vi anser vara den gyllene standarden för att erhålla reproducerbara resultat i leverresektioner och perfusioner i samband med in situ NMR-experiment. Avståndet till mitten av fältet för magneten samt vävnadens otillgänglighet för intervention under NMR-experimentet gör våra metoder nya.
Introduction
Ex vivo-perfusioner är avgörande för studier av levermetabolism, och perfusion genom portalvenen är standarden för dessa studier. För att studera levermetabolismen isolerat måste levern resekteras från kroppen för att undvika komplikationer som uppstår vid metabolism i andra organ (dvs. hela kroppens metabolism) och för att utöva kontroll över hormontillgängligheten (insulin, glukagon, etc.). Detta tillvägagångssätt kan vara viktigt för att förstå effekterna av sjukdomar som diabetes, NAFLD och NASH på levermetabolism samt mekanismer för läkemedelsverkan. Denna artikel fungerar som en guide till leverresektion och perfusion. Vi har utvecklat ett strömlinjeformat förfarande för att utföra dessa metaboliska leverstudier med tillräcklig noggrannhet och reproducerbarhet. Om operationen inte utförs korrekt finns det uttalad variation i de erhållna metaboliska data. Vi beskriver en organiserad metod för att utföra portalvenskateterisering och leverresektion i samband med metaboliska studier in situ i en kärnmagnetisk resonansspektrometer (NMR), som beskrivs i litteraturen 1,2,3,4,5.
För närvarande finns det ingen litteratur som beskriver en ex vivo leverperfusion med användning av en glaskolonn i en NMR. Det finns inte heller en video- eller textpublikation som ger ett tydligt exempel på hur man utför proceduren med muslevern, specifikt, som visar hur man kateteriserar portalvenen, resekterar en lever, överför och hänger levern på en glaskolonn. Eftersom den genetiskt modifierade musen används allestädes närvarande för att studera levermetabolism är detta ett viktigt förfarande som förtjänar en fullständig beskrivning. Leverperfusionsoperationer är inte nya, men den här artikeln är en guldstandardmetod åtföljd av en video som visar den tekniska excellensen som beskrivs i detta dokument för att hjälpa alla som är intresserade av denna procedur. Metoden som presenteras här skulle bäst tillämpas på realtidsmetabolism för att detektera funktionen och omsättningen av metaboliter i sjukdomsmodeller.
Denna metod använder en 100 cm vattenmantlad glaskolonn, som gör att levern kan hänga i botten av kanylen inkapslad genom att perfusera inuti ett NMR-rör. Uppvärmt vatten i glasjackan används för att kontrollera perfusattemperaturen. En tunnskikts oxygenator trycksätts med 95% / 5% O2 / CO2 för pH-kontroll. Genom att använda tre separata pumpar ställs perfusatkolonnhöjden in, vilket ger konstant tryck på levern. Flödeshastigheterna kontrolleras inte utöver tillämpningen av konstant tryck (figur 1). För att bekräfta att levern fungerar korrekt tas syremätningar tillsammans med flödeshastigheter. I våra händer leder denna uppsättning förutsättningar till mycket repeterbara NMR-experiment för bedömning av leverns metaboliska funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta kirurgiska ingrepp är utmanande och kräver omfattande övning för att uppnå reproducerbara resultat. Isofluran och bärgas bör justeras efter behov för att bibehålla djurets livskraft genom så mycket av det kirurgiska ingreppet som möjligt. Miljö, tid på dagen, ålder, vikt och flera andra faktorer kommer att påverka anestesi. Vikt, kost, stam av möss och ålder kan påverka kirurgi eftersom fettuppbyggnad kan störa visualiseringen av portalvenen. Vid tejpning av tassarna måste man se till att inte b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). En del av detta arbete utfördes i McKnight Brain Institute vid National High Magnetic Field Laboratory’s Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, som stöds av National Science Foundation Samarbetsavtal nr. DMR-1644779 och delstaten Florida.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
