वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) में ट्रिगर सेलुलर गतिविधि के ऑल-ऑप्टिकल नियंत्रण और अवलोकन का वर्णन करता है। समय और स्थान में फेनोटाइपिक पैटर्न का बहु-पैरामीट्रिक परिमाणीकरण दिखाया गया है। घंटों में दवाओं के दीर्घकालिक प्रभाव, या दिनों में अनुक्रमिक माप, प्रदर्शित किए जाते हैं।
यह समझना कि स्वास्थ्य और बीमारी में उत्तेजित कोशिकाएं कैसे काम करती हैं और छोटे अणुओं या आनुवंशिक हेरफेर द्वारा उस व्यवहार को कैसे बदला जा सकता है, महत्वपूर्ण है। कई उत्सर्जन खिड़कियों के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) को जोड़ा जा सकता है (उदाहरण के लिए, अलग-अलग उपकोशिकीय घटनाओं के एक साथ अवलोकन के लिए) या उत्तेजित कोशिकाओं में अन्य प्रकाश-निर्भर एक्ट्यूएटर के साथ विस्तारित अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वर्णक्रमीय रूप से संगत कैल्शियम संकेतकों के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण का संयोजन)। इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग प्राथमिक या स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स, कार्डियोमायोसाइट्स और अग्नाशयी बीटा-कोशिकाओं में किया गया है। हालांकि, उपकरणों, विश्लेषण सॉफ्टवेयर, संकेतक प्रदर्शन और जीन वितरण दक्षता की सीमाओं के कारण ऐसे दृष्टिकोणों के थ्रूपुट, या अवलोकन की अवधि को बढ़ाना चुनौतीपूर्ण रहा है। यहां, एक उच्च प्रदर्शन वाले हरे रंग के जीईसीआई, एमएनियोनग्रीन-जीईसीओ (एमएनजी-जीईसीओ), और लाल-स्थानांतरित जीईसीआई, के-जीईसीओ, को ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण के साथ जोड़ा जाता है ताकि उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग प्रारूप में सेलुलर गतिविधि के ऑल-ऑप्टिकल नियंत्रण और विज़ुअलाइज़ेशन को प्राप्त किया जा सके। स्वस्थ और रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी-सीएम के साथ कार्डियोटॉक्सिसिटी परीक्षण और फेनोटाइपिक दवा स्क्रीनिंग का प्रदर्शन करने वाले अनुप्रयोग दिखाए गए हैं। इसके अलावा, वर्णक्रमीय और कैल्शियम आत्मीयता संकेतक वेरिएंट (एनआईआर-जीईसीओ, एलएआर-जीईसीओ, और एमटीजीसीईपीआईए या ओराई 1-जी-जीईसीओ) के संयोजन का उपयोग करके बहु-पैरामीट्रिक आकलन भी आईपीएससी-सीएम मॉडल में विभिन्न सेलुलर डिब्बों तक ही सीमित हैं।
मानव-आधारित प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न मॉडल को पशु अध्ययन 1,2 के लिए निर्धारित 3आर उद्देश्यों (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) के लिए एक आशाजनक समाधान माना जाता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग रोग मॉडलिंग और दवा की खोज के लिए किया गया है क्योंकि वे मानव जीव विज्ञानके आवश्यक पहलुओं को पुन: परिभाषित करते हैं। कैल्शियम इमेजिंग, आमतौर पर रासायनिक रंगों के साथ, दवा उपचार से पहले और बाद में सेलुलर गतिविधि का निरीक्षण करनेके लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, रासायनिक डाई-आधारित कैल्शियम-सेंसिंग जांच सीधे एनए, के-एटीपीस को रोकती है और सेलुलर फ़ंक्शन6 को बाधित करती है। इस प्रकार, घंटों या दिनों में एक ही कोशिकाओं को ट्रैक करना समस्याग्रस्त रहा है जब रासायनिक रंगों का उपयोग किया जाता है। यहां, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) 7,8,9,10 की एक श्रृंखला का उपयोग एक व्यापक उत्तेजना / उत्सर्जन और कैल्शियम आत्मीयता स्पेक्ट्रम में किया जाता है ताकि कार्डियक विषाक्तता परीक्षण मंच बनाया जा सके जो11 की विस्तारित अवधि में वास्तविक समय बहु-ऑर्गेनेल माप प्रदान करता है।
लाल-स्थानांतरित कैल्शियम संकेतक की सह-अभिव्यक्ति द्वारा ऑप्टिकल नियंत्रण और कैल्शियम इमेजिंग के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोड किए गए उपकरणों का उपयोग करके आईपीएससी-सीएम मॉडल में उच्च-थ्रूपुट कैल्शियम-आधारित स्क्रीनिंग अवधारणा को पहले से प्रदर्शित शैक्षणिक संदर्भ से परे विकसित करने के लिए, आर-जीईसीओ या के-जीईसीओ के साथ एक ऑप्टोजेनेटिक टूल, सीएचआर2 12,13, ऑफ-द-शेल्फ वायरल किट उत्पन्न किए गए हैं। इमेजिंग को ऑटो-माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम से लैस एक उच्च-सामग्री उपकरण में संक्रमण करके, यौगिक जोड़ के एकल-चैनल पिपेटिंग को लाइव-सेल इमेजिंग के शीर्ष पर स्तरित किया जाता है। अंत में, प्रयोगात्मक मार्ग, छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण के दोनों महत्वपूर्ण पहलुओं में सुधार और स्वचालित हैं।
उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सफलतापूर्वक करने के लिए, संकेतों को संस्कृति पोत में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए, यह गारंटी देते हुए कि इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों (आरओआई) को स्वचालित रूप से लागू किया जा सकता है। यद्यपि रासायनिक कैल्शियम संकेतक आसानी से इस आवश्यकता को पूरा करते हैं, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच ने ऐतिहासिक रूप से शीट के बजाय पैच का उत्पादन किया है, जो उनके उपयोग को सीमित करते हैं। एक वायरल ट्रांसडक्शन सिस्टम का उपयोग पारंपरिक अभिकर्मक विधियों की तुलना में लक्ष्य कोशिकाओं के बीच कई संकेतकों के उच्च 27,28 और समकक्ष अभिव्यक्ति स्तर प्रदान करता है। विभिन्न सेल प्रकारों को अलग-अलग प्रमोटरों की आवश्यकता हो सकती है, और जीन वितरण प्रणाली की पसंद कोतदनुसार 29,30,31 बदलने की आवश्यकता हो सकती है। विषम सेल मॉडल में, ट्रांसडक्शन और अभिव्यक्ति दक्षता विशिष्ट सेल प्रकारों में भिन्न हो सकती है। एक ओर, यह विशेष कोशिकाओं के आवेदन को सीमित कर सकता है, लेकिन सह-संस्कृति प्रणाली32 में विशेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए घटना का शोषण किया जा सकता है।
इस दृष्टिकोण का मुख्य प्रभाव स्वचालन द्वारा प्रयोगकर्ता और नमूने के बीच एक-से-एक संबंध से मुक्ति है। एक मानक बहु-कुएं के प्रयोग में, एक ही कुएं के भीतर चार पदों पर डेटा एकत्र करने के लिए, हमारा अनुमान है कि 96 वेल प्लेट से 30 एस वीडियो इकट्ठा करने के लिए माइक्रोस्कोप में लगभग 15 घंटे लगते हैं। स्वचालित प्रणाली में, इसमें ~ 4 घंटे लगते हैं। इसके अलावा, मैन्युअल रूप से डेटा का विश्लेषण डेटा अधिग्रहण की तुलना में कहीं अधिक समय लेता है। यहां उपयोग की जाने वाली विश्लेषण प्रणाली मैनुअल समकक्ष की तुलना में लगभग 200 गुना तेज है। शुद्ध परिणाम एक बेहतर वर्कफ़्लो और उच्च लागत और समय की बचत है।
कैल्शियम रंगों से भरे प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स के विपरीत जो घंटों के क्रम में जीवित रहते हैं, वायरल डिलीवरी सिस्टम के माध्यम से आईपीएससी-सीएम में व्यक्त जीईसीआई एक प्रयोगात्मक मॉडल में एक संकेत दे सकते हैं जो कुछ महीनों तक रहता है। इन मॉडलों को एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में बनाए रखा जा सकता है और छोटे अणु स्क्रीनिंग के लिए विकसित उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम में सीरियल विश्लेषण के लिए एक साथ ट्रैक किया जा सकता है। यह आमतौर पर विष विज्ञान परख में उपयोग किए जाने वाले मिनटों के बजाय रोगियों (सप्ताह या महीनों) द्वारा अनुभव किए गए अवधि में दवा प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक सरल मानव प्रयोगात्मक मंच का उत्पादन करता है।
प्रणाली को हरे से लेकर इन्फ्रा-रेड तक अलग-अलग उत्सर्जन गुणों वाले जीईसीआई को शामिल करके बहु-पैरामीटर माप प्रदान करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इस तरह के प्रयोगों को संकेतों को अलग रखने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में उचित उत्तेजना प्रकाश और फिल्टर सेट की आवश्यकता होती है। दवा स्क्रीनिंग संदर्भ में व्यापक अनुप्रयोग के लिए दवा वितरण के अलावा मजबूत और कुशल विश्लेषण प्लेटफार्मों की आवश्यकता होती है। यद्यपि यहां वर्णित मॉडल कई गतिशील कैल्शियम संकेतकों के उपयोग पर केंद्रित है, इसे सेल फॉर्म या फ़ंक्शन के संरचनात्मक मार्करों में संशोधित किया जा सकता है। ये आम तौर पर कल्पना करना आसान होता है क्योंकि वे इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में सौ गुना भिन्नता की तुलना में थोड़ा बीट-टू-बीट परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। यह दृष्टिकोण दुर्लभ-बीमारी के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हो सकता है जहां रोगियों से प्राप्त आईपीएससी मध्यवर्ती में एक विशेष स्थिति के सभी आनुवंशिक चालक और संशोधक शामिल हो सकते हैं जिन्हें एक स्केलेबल सेल मॉडल में संरक्षित किया जा सकता है, सेलुलर फेनोटाइप के आधार पर विभिन्न बीमारियों में दवा की खोज की सुविधा प्रदान की जा सकती है जिन्हें जैविक तंत्र के आधार पर स्वतंत्र रूप से देखा जा सकता है जिसे स्पष्ट करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
रॉबर्ट कैंपबेल को सामग्री और मूल्यवान चर्चा साझा करने के लिए टोक्यो विश्वविद्यालय में धन्यवाद देते हैं; तकनीकी सहायता के लिए आणविक उपकरण में डॉ चिया-लिन हो।
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |