Tidlig utvikling er avhengig av mors arvede produkter, og rollen til mange av disse produktene er foreløpig ukjent. Her beskrev vi en protokoll som bruker CRISPR-Cas9 for å identifisere fenotyper med morseffekt i en enkelt generasjon.
Tidlig utvikling avhenger av et basseng av maternelle faktorer innlemmet i den modne oocytten under oogenese som utfører alle cellulære funksjoner som er nødvendige for utvikling til zygotisk genomaktivering. Vanligvis krever genetisk målretting av disse maternelle faktorene en ekstra generasjon for å identifisere fenotyper med morseffekt, noe som hindrer evnen til å bestemme rollen som maternalt uttrykte gener under utvikling. Oppdagelsen av de bialleliske redigeringsegenskapene til CRISPR-Cas9 har gjort det mulig å screene embryonale fenotyper i somatisk vev av injiserte embryoer eller “crispants”, noe som øker forståelsen av rollen zygotisk uttrykte gener spiller i utviklingsprogrammer. Denne artikkelen beskriver en protokoll som er en utvidelse av crispant-metoden. I denne metoden tillater den bialleliske redigeringen av kimceller isolering av en morseffektfenotype i en enkelt generasjon, eller “mors crispants.” Multiplexing guide RNA til et enkelt mål fremmer effektiv produksjon av maternelle crispants, mens sekvensanalyse av mors crispant haploider gir en enkel metode for å bekrefte genetiske lesjoner som produserer en morseffekt fenotype. Bruken av mors crispants støtter rask identifisering av essensielle maternalt uttrykte gener, og letter dermed forståelsen av tidlig utvikling.
En pool av maternalt deponerte produkter (f.eks. RNA, proteiner og andre biomolekyler) er nødvendig for alle tidlige cellulære prosesser til embryoets zygotiske genom er aktivert1. For tidlig uttømming av disse produktene fra oocytten er vanligvis embryonal dødelig. Til tross for betydningen av disse genene i utvikling, er rollen til mange maternalt uttrykte gener for tiden ukjent. Fremskritt i genredigeringsteknologi i sebrafisk, som CRISPR-Cas9, muliggjør målretting av maternalt uttrykte gener 2,3,4. Imidlertid krever identifisering av en morseffektfenotype en ekstra generasjon sammenlignet med en zygotisk fenotype, og krever dermed flere ressurser. Nylig har den bialleliske redigeringsevnen til CRISPR-Cas9 blitt brukt til å skjerme for embryonale fenotyper i somatisk vev av injiserte (F0) embryoer, kjent som “crispants”5,6,7,8,9,10. Crispant-teknikken tillater ressurseffektiv screening av kandidatgener i somatiske celler, noe som letter forståelsen av spesifikke aspekter i utviklingen. Protokollen beskrevet i dette papiret gjør det mulig å identifisere fenotyper av morseffekter, eller “maternelle crispants”, i en enkelt generasjon11. Denne ordningen er oppnåelig ved multipleksing guide RNA til et enkelt gen og fremme bialleliske redigeringshendelser i kimlinjen. Disse mors sprø embryoene kan identifiseres ved brutto morfologiske fenotyper og gjennomgå primær karakterisering, for eksempel merking for cellegrenser og DNA-mønster11. Kombinert analyse av den observerbare fenotypen og grunnleggende molekylær karakterisering av de induserte INDEL-ene gjør det mulig å forutsi det målrettede genets rolle i tidlig utvikling.
I sebrafisk, i løpet av de første 24 timene etter befruktning (hpf), utvikler en liten gruppe celler seg til de opprinnelige kimcellene, en forløper til kimlinjen12,13,14,15. I koblinger lagt av F0-kvinner avhenger andelen av mors sprø embryoer som gjenvinnes, av hvor mange kimceller som inneholder en biallelisk redigeringshendelse i det målrettede genet. Generelt, jo tidligere redigeringshendelsen oppstår i embryoet, desto større er sannsynligheten for at CRISPR-Cas9-mutasjoner blir observert i kimlinjen. I de fleste tilfeller kommer fenotypene av mors sprø embryoer fra tap av funksjon i de to mors allelene som er tilstede i den utviklende oocytten. Når oocytten fullfører meiose, ekstruderes en av mors alleler fra embryoet via polarlegemet, mens det andre allelet blir innlemmet i mors pronukleus. Sekvenseringen av flere mors sprø haploider vil representere en blanding av mutasjonene (innsettinger og/eller delesjoner (INDELs)) som er tilstede i kimlinjen som bidrar til fenotype11.
Følgende protokoll beskriver de nødvendige trinnene for å lage CRISPR-Cas9-mutasjoner i morseffektgener og identifisere den tilsvarende fenotypen ved hjelp av en mors crispant-tilnærming (figur 1). Del en vil forklare hvordan man effektivt kan designe og lage guide-RNA, mens seksjon to og tre inneholder kritiske trinn for å lage mors crispants ved mikroinjeksjon. Etter injeksjon av CRISPR-Cas9-blandingen, blir injiserte embryoer screenet for somatiske redigeringer via PCR (avsnitt fire). Når de injiserte F0-embryoene utvikler seg og når seksuell modenhet, krysses F0-hunnene til villtypehanner, og deres avkom blir screenet for fenotyper av moderlig effekt (avsnitt fem). Seksjon seks inneholder instruksjoner om å lage mors sprø haploider som kan kombineres med Sanger-sekvensering for å identifisere CRISPR-Cas9-induserte INDELer. I tillegg inneholder diskusjonen endringer som kan gjøres i protokollen for å øke følsomheten og kraften til denne metoden.
Protokollen som presenteres i dette manuskriptet tillater identifisering og primærmolekylær karakterisering av en morseffektfenotype i en enkelt generasjon i stedet for flere generasjoner som kreves for både fremover og bakover genetiske teknikker. For tiden er rollen til mange maternalt uttrykte gener ukjent. Denne mangelen på kunnskap skyldes delvis den ekstra generasjonen som kreves for å visualisere en fenotype når man identifiserer morseffektgener. Tidligere kunne rask identifisering av morseffektgener i sebra…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker tidligere og nåværende Pelegri lab husdyrhold ansatte for deres omsorg for akvatiske anlegget. Vi er også takknemlige for kommentarer og innsikt i manuskriptet av Ryan Trevena og Diane Hanson. Finansiering ble gitt av NIH-tilskudd til F.P. (GM065303)
1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
Gloves | Any Maker | ||
Ice Bucket | Any Maker | ||
Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
Male & Female zebrafish | |||
MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
Micropipeters | Any Maker | ||
Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
Microwave | Any Maker | ||
Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
Nanodrop | Any Maker | ||
NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
nuclease-free water | Any Maker | ||
Paper Towel | Any Maker | ||
Pastro Pipettes | Any Maker | ||
PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
Scale | Any Maker | ||
Sharpie | Any Maker | ||
Spatula | Any Maker | ||
Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
Tape | Any Maker | ||
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
Thermocycler | Any Maker | ||
Thermocycler | Any Maker | ||
Transilluminator | Any Maker | ||
UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
100% RNAse free ethanol | any maker | ||
5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
Agarose | any maker | ||
CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
Computer | any maker | ||
Dissecting Forcepts | any maker | ||
Dissecting Microscope | any maker | ||
Dissecting Scissors | any maker | ||
DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
Fish Net | any maker | fine mesh | |
Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
Gel Electropheresis System | any maker | ||
Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
Glass Dishes | any maker | ||
Gloves | any maker | ||
Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
Hanks Solution | |||
Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
Ice Bucket | any maker | ||
Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Male and Female zebrafish | |||
Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
Microimicromanipulator | |||
Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
Microinjector | |||
Microneedle Slide | |||
Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
Microplastic slide | |||
Microwave | any maker | ||
MiliQ Water | any maker | ||
mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
Na2HPO4 | Sigma | ||
NaCl | Sigma | S9888 | |
NaHC02 | Sigma | 223441 | |
Nanodrop | |||
NaOH | Sigma | 567530 | |
Narrow Spatula | any maker | ||
Needle Puller | Sutter | P-97 | |
Paper Towel | any maker | ||
Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
Plastic Spoon | any maker | ||
Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
Razor Blade | Uline | H-595B | |
RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
Scale | any maker | ||
Sharpie | any maker | ||
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
Software for sanger sequencing Analysis | |||
Spectrophotometer | |||
Sterlie H2O | any brand | ||
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
Tape | any brand | ||
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
Thermocycler | |||
Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
Transilluminator | |||
Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
UV lamp | UVP | ||
UV safety glasses | any maker | ||
Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
Zebrafish mating boxes | any maker | ||
PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |