Установлен метод реактивации покоящихся нервных стволовых клеток в культивируемых эксплантах мозга дрозофилы . Используя этот метод, роль системных сигналов может быть отделена от тканевых внутренних сигналов в регуляции покоя, входа и выхода нервных стволовых клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Реактивация нервных стволовых клеток в культивируемых эксплантах мозга дрозофилы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нервные стволовые клетки (НСК) обладают способностью пролиферировать, дифференцироваться, подвергаться апоптозу и даже входить и выходить из покоя. Многие из этих процессов контролируются сложным взаимодействием между внутренними генетическими программами НСК с внешними факторами НБК, локальными и системными. В генетическом модельном организме , Drosophila melanogaster, NSC, известные как нейробласты (NB), переключаются с покоя на пролиферацию во время эмбрионального перехода к личиночному. За это время личинки выходят из своей яичной скорлупы и начинают ползать, ища диетические питательные вещества. В ответ на кормление животных жировое тело, эндокринный орган с емкостью для хранения липидов, вырабатывает сигнал, который системно высвобождается в циркулирующую гемолимфу. В ответ на сигнал, полученный из жирового тела (FBDS), инсулиноподобные пептиды Drosophila (Dilps) производятся и высвобождаются из нейросекреторных нейронов мозга и глии, что приводит к последующей активации сигналов роста PI3-киназы в NB и их глиальной и трахеальной нише. Хотя это текущая модель того, как НБ переключаются с покоя на распространение, природа внешнего сигнала FBDS остается неуловимой. Чтобы лучше понять, как внешние системные сигналы NB регулируют выход из покоя, был разработан метод культивирования раннего личиночного мозга in vitro перед кормлением животных. С помощью этого метода экзогенные факторы могут подаваться в культуральную среду и выходить NB из анализа покоя. Мы обнаружили, что экзогенного инсулина достаточно для реактивации NB из покоя в эксплантах всего мозга. Поскольку этот метод хорошо подходит для крупномасштабных экранов, мы стремимся выявить дополнительные внешние сигналы, которые регулируют NB по сравнению с решениями о распространении. Поскольку гены и пути, которые регулируют решения о пролиферации НСК, эволюционно сохраняются, результаты этого анализа могут дать представление об улучшении регенеративной терапии в клинике.
Введение
Стволовые клетки представляют большой интерес из-за их потенциала для использования в регенеративной медицине 1,2. Многие животные, особенно долгоживущие, поддерживают стволовые клетки во взрослых тканях. Эти резидентные стволовые клетки функционируют для поддержания тканевого гомеостаза и используются для восстановления после физической травмы или заболевания 3,4. Большинство стволовых клеток у взрослых животных находятся в состоянии покоя, относительно спящем состоянии, характеризующемся остановкой клеточного цикла и инактивацией сигналов роста
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Коллекция личинок дрозофилы
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дрожжевую тарелку, виноградную пасту и кондоминиум Fly перед началом:
- Дрожжевая паста: В небольшой емкости смешайте 5 г активных сухих дрожжей с 10 мл воды, чтобы сформировать пасту, которая имеет консистенцию арахисового масла. Накройте дрожжевую пасту полиэтиленовой пленкой и используйте резинку, чтобы прочно прикрепить ее к контейнеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежая дрожжевая паста будет расширяться в своем контейнере и будет отрываться от крышки, если ее не прочно закрепить. Дрожжевая паста прослужит несколько дней при комнатной температуре (RT).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Свежевылупившиеся мозги дикого типа OregonR были рассечены и культивированы в течение 24 ч в дополненной среде Шнайдера (SSM) инсулином. Ткани фиксировались и окрашивались согласно протоколу. Использовались первичные антитела, генерируемые против Deadpan (Dpn) для обнаружения NB и Scribble для маркировки клеточных мембран. Аналог тимидина 5-этинил-2'-дезоксиуридин (Edu) был добавлен для обнаружения входа в S-фазу и реактивации NB. Мы обнаружили большие Edu положительные и Dpn положительные NB через 24 ч в культуре (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь способ культивирования эксплантов мозга может быть выполнен в большинстве лабораторных сред. Необходимые инструменты, а также процедура и сбор данных просты и понятны. С помощью этого метода можно проверить различные гипотезы, в том числе связанные с клеточными сигнальными каскадами и внешними факторами, которые регулируют реактивацию и пролиферацию NB. Здесь, используя диких животных OregonR, мы обнаружили, что экзогенного инсулина было достаточно для реактивации NB из покоя независимо от других специфич.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Мы приветствуем программу LSAMP Bridges to Doctorate для финансирования (CNK), а также NIH / NIGMS (R01-GM120421 и R35-GM141886). Мы благодарны доктору Конору Сайпу за рисунок 1. Мы также благодарим всех членов лаборатории Siegrist за их постоянную поддержку и наставничество. Мы особенно благодарим Чхави Суда и Гэри Титерса за внимательное прочтение рукописи и за предоставленные комментарии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10 & микро; L Наконечники для пипеток | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 &; L Наконечники для пипеток | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µ L Пипеттор | Gilson | P1000 | |
| 16% параформальдегид (10 x 10 мл) | Электронная микроскопия | 2912.60.0000 | Используется для фиксации мозга личинок |
| 20 & микро; L Пипетка | Gilson | P20 | |
| 200 & L Наконечники для пипеток | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-луночные многолуночные планшеты для культивирования | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 мм чашки | Петри Fisher Scientific | 08-757-100A | Ингредиенты виноградной тарелки |
| 4 ° C холодильник | Fisher Scientific | Обеспечивает идеальную температуру для >24 ч инкубации в растворе антител | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Активные сухие дрожжи | Большинство супермаркетов | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Ингредиенты виноградной тарелки |
| Click-iT EdU Набор для пролиферации клеток для визуализации, Alexa Fluor 647 краситель | Thermo Fisher Scientific | C10340 | для маркировки пролиферирующих клеток |
| Конфокальный микроскоп | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 мм x 22 мм x 1 мм, 10 упаковка по 4 унции | Fisher Scientific | 12-544-10 | Два покровных стекла супер приклеены к концам предметного стекла микроскопа. Это создает пространство, которое позволяет мозгу плавать в антифейде во время визуализации. |
| Покровные стекла, 22 мм x 50 мм x 1 мм | Fisher Scientific | 12-545E | Покровная крышка размещена на двух квадратных покровных накладках на предметном стекле микроскопа, что гарантирует, что мозг в защитном стеколе не будет двигаться во время визуализации. |
| Препарирующий микроскоп | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 галлон флакон | Fisher | Scientific 2701 | Используется для смывания личинок перед 24-часовой выдержкой в культуральной среде |
| Фетальная бычья сыворотка (10%) | Sigma | F4135-100ML | Добавка для клеточных культуральных сред. |
| Тонкие щипцы для диссекции | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts, используемые при диссекциях. Они лучше всего работают при заточении. |
| Флаконы для скрещивания | Genessee Scientific | 32-130 | Эта бутылка используется в качестве контейнера, который позволяет мухам откладывать яйца на виноградной тарелке. |
| Стеклянная чашка для препарирования (3 лунки) | Эти больше не доступны | ||
| Глутатион | Sigma | G6013 | Обеспечивает окислительную защиту во время культивирования клеток. |
| Козья сыворотка | Sigma | G9023- 10ML | Блокатор |
| Виноградные тарелки | Сделано в | доме Сделано в доме | Пластины из виноградного сока/агарозы для сбора свежевылупившихся яиц |
| Изображение J | Imagej.net/fiji/downloads | Скачать бесплатно: https://fiji.sc | Платформа визуализации, которая используется для подсчета клеток и реактивации Edu |
| Инкубатор | Thermo Fisher Scientific | Гарантирует, что температура, влажность и воздействие света будут абсолютно одинаковыми на протяжении всего эксперимента. | |
| Инсулин | Sigma | I0516 | Независимая переменная эксперимента |
| Ламинарный проточный колпак | Для аликвотирования питательных сред | ||
| L-глутамин | Sigma | G7513 | Обеспечивает поддержку во время культивирования клеток |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | В этом лотке выполняются этапы иммуноокрашивания |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Пленка используется для герметизации пластин с целью предотвращения испарения |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Антибиодик используется для предотвращения бактериального загрязнения клеток во время культивирования. |
| Фосфатный буфер, pH7.4 | Сделано в домашних | Сделано в домашних | Растворитель используется для промывания мозга после этапов фиксации и окрашивания |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Используется для сбора личинок с виноградной пластины |
| Пропионовая кислота | Fisher Scientific | A-258 | Ингредиенты виноградной пластины |
| Кролик 405 | Abcam | ab175653 | Антитела используются для иммуноокрашивания |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Антитела, используемые для иммуноокрашивания |
| Rb Scribble | A Gift от Криса Доу | Антитела, используемые для иммуноокрашивания | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Антитела, используемые для иммуноокрашивания |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Содержит питательные вещества, которые помогают клеткам расти и размножаться |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 мл) | Life Tech | S36963 | Реагент, обеспечивающий защиту от выцветания флуорофоров |
| Стерильная вода | Автоклав Milli-Q собственного производства | Требуется для растворов | |
| Сахароза | Fisher | S2-12 | Виноградная тарелка Ингредиенты |
| Superfrost Микроскоп Предметные стекла | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Большинство супермаркетов | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Ингредиенты виноградной тарелки |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% виноградный виноградный сок Большинство | супермаркетов | Ингредиенты виноградной тарелки |
Ссылки
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Plur....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
