Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados

Resumen

Se ha establecido un método para reactivar las células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de Drosophila cultivados. Usando este método, el papel de las señales sistémicas se puede desacoplar de las señales intrínsecas del tejido en la regulación de la inactividad, entrada y salida de las células madre neurales.

Resumen

Las células madre neurales (NSC) tienen la capacidad de proliferar, diferenciarse, sufrir apoptosis e incluso entrar y salir de la inactividad. Muchos de estos procesos están controlados por la compleja interacción entre los programas genéticos intrínsecos del NSC con los factores extrínsecos del NSC, locales y sistémicos. En el organismo modelo genético, Drosophila melanogaster, las NSC, conocidas como neuroblastos (NB), cambian de la inactividad a la proliferación durante la transición embrionaria a larvaria. Durante este tiempo, las larvas emergen de sus cáscaras de huevo y comienzan a gatear, buscando nutrientes dietéticos. En respuesta a la alimentación animal, el cuerpo graso, un órgano endocrino con capacidad de almacenamiento de lípidos, produce una señal, que se libera sistémicamente en la hemolinfa circulante. En respuesta a la señal derivada del cuerpo graso (FBDS), los péptidos similares a la insulina Drosophila (Dilps) se producen y liberan de las neuronas neurosecretoras cerebrales y la glía, lo que lleva a la activación posterior de la señalización de crecimiento de PI3-quinasa en NB y su nicho glial y traqueal. Aunque este es el modelo actual de cómo los NB cambian de la inactividad a la proliferación, la naturaleza de la señal extrínseca FBDS sigue siendo difícil de alcanzar. Para comprender mejor cómo las señales sistémicas extrínsecas NB regulan la salida de la inactividad, se desarrolló un método para cultivar cerebros larvarios tempranos in vitro antes de la alimentación animal. Con este método, se pueden suministrar factores exógenos a los medios de cultivo y se puede ensayar la salida de NB de la inactividad. Encontramos que la insulina exógena es suficiente para reactivar los NB de la inactividad en los explantes de todo el cerebro. Debido a que este método es adecuado para pantallas a gran escala, nuestro objetivo es identificar señales extrínsecas adicionales que regulen la inactividad NB frente a las decisiones de proliferación. Debido a que los genes y las vías que regulan las decisiones de proliferación de NSC se conservan evolutivamente, los resultados de este ensayo podrían proporcionar información sobre la mejora de las terapias regenerativas en la clínica.

Introducción

Las células madre son de gran interés por su potencial de uso en medicina regenerativa ^1,2. Muchos animales, especialmente aquellos que son de larga vida, mantienen células madre dentro de sus tejidos adultos. Estas células madre residentes funcionan para mantener la homeostasis tisular y se utilizan para la reparación después de una lesión física o enfermedad ^3,4. La mayoría de las células madre en animales adultos están inactivas, un estado relativamente latente caracterizado por la detención del ciclo celular y la inactivación de la señalización del....

Protocolo

1. Recolección de larvas de Drosophila

NOTA: Prepare el plato de levadura, la pasta de uva y el condominio Fly antes de comenzar:

1. Pasta de levadura: En un recipiente pequeño, mezcle 5 g de levadura seca activa con 10 ml de agua para formar una pasta que tenga la consistencia de la mantequilla de maní. Cubra la pasta de levadura con una envoltura de plástico y use una banda elástica para unirla firmemente al recipiente.
   NOTA: La pasta de levadura fresca se expandirá en su recipiente y saldrá de la tapa a menos que esté firmemente unida. La pasta de levadura durará varios días a temperatura ambiente (RT)....

Resultados

Los cerebros de tipo salvaje OregonR recién nacidos fueron diseccionados y cultivados durante 24 horas en medios de Schneider suplementados (SSM) con insulina. Los tejidos se fijaron y teñieron de acuerdo con el protocolo. Se utilizaron anticuerpos primarios generados contra Deadpan (Dpn) para detectar NB y Scribble para etiquetar las membranas celulares. Se agregó el análogo de timidina 5-Etinil-2′-desoxiuridina (Edu) para detectar la entrada en fase S y la reactivación de NB. Se encontraron NB Edu positivos y Dpn posit.......

Discusión

El método descrito aquí para cultivar explantes cerebrales se puede llevar a cabo en la mayoría de los entornos de laboratorio. Las herramientas requeridas, así como el procedimiento y la recopilación de datos, son simples y directas. Con este método, se pueden probar una variedad de hipótesis, incluidas las relacionadas con las cascadas de señalización celular y los factores extrínsecos que regulan la reactivación y proliferación de NB. Aquí, utilizando animales OregonR de tipo salvaje, encontramos que la insulina exóge.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 y micro; L Puntas de pipeta	Denville Sci	P2102
1000 µ L Puntas de pipeta	Denville Sci	P2103-N
1000 µ L Pipeta	Gilson	P1000
16% paraformaldehído (10 x 10 mL)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	2912.60.0000	Utilizada para la fijación de cerebros de larvas
20 µ L Pipeta	Gilson	P20
200 µ L Puntas de pipeta	Denville Sci	1158U56
Placas de cultivo multipocillos de 24 pocillos	Fisher Scientific	50-197-4477
Placas de Petri de 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A Plato de	uva Ingredientes
4 ° Refrigerador C	Fisher Scientific		Proporciona una temperatura ideal para incubaciones de >24 h en solución de anticuerpos
63x Objetivo	Lecia
Levadura seca activa	La mayoría de los supermercados
Agarosa	Fisher Scientific	214010	Plato de uva Ingredientes
Click-iT EdU Kit de proliferación celular para imágenes, Alexa Fluor 647 colorante	Thermo Fisher Scientific	C10340	para etiquetar células en proliferación
Microscopio Confocal	Leica	SP8
Cubreobjetos 22 mm x 22 mm x 1 mm , paquete de 10 4 oz	Fisher Scientific	12-544-10	Dos cubreobjetos están súper pegados a los extremos del portaobjetos del microscopio. Esto crea un espacio que permite que los cerebros floten en antidesvanecimiento mientras se toman imágenes.
Cubreobjetos, 22 mm x 50 mm x 1 mm	Fisher Scientific	12-545E	El cubreobjetos se coloca en dos cubreobjetos cuadrados en el portaobjetos del microscopio, lo que garantiza que el cerebro en el antidesvanecedor no se mueva durante la obtención de imágenes.
Microscopio de disección	Zeiss	Stemi 2000
Etanol 200 proof (100%), Decon Labs, botella de 1 galón	Fisher Scientific	2701	Se utiliza para lavar las larvas antes de la retención de 24 horas en el medio
de cultivo Suero fetal bovino (10%)	Sigma	F4135-100ML	Suplemento para medios de cultivo celular.
Pinzas finas para disección	Fine Science Tools	11295-20	Forcepts utilizados en disecciones. Funcionan mejor cuando están afilados.
Botellas de moscas para cruzar	Genessee Scientific	32-130	Esta botella se utiliza como recipiente que permite a las moscas poner huevos en el plato de uva.
Plato de disección de vidrio (3 pocillos)	Ya no están disponibles
Glutatión	Sigma	G6013	Proporciona protección oxidativa durante el cultivo celular.
Suero de cabra	Sigma	G9023- 10ML	Agente Bloqueador
Platos de uva Hecho	en casa	Hecho en casa	Platos de jugo de uva / agarosa para recolectar huevos recién eclosionados
Imagen J	Imagej.net/fiji/downloads	Descarga gratis:  https://fiji.sc	Plataforma de imágenes que se utiliza para contar células y Incubadora de reactivación
	Edu Thermo Fisher Scientific		Garantiza que la temperatura, la humedad y la exposición a la luz sean exactamente las mismas durante todo el experimento.
Insulina	Sigma	I0516	Variable independiente del experimento
		flujo laminar	Para medios de cultivo alícuotas
L-Glutamina	Sigma	G7513	Proporciona apoyo durante el cultivo celular
Nunc 72-pocillos Micropocillos Mini Bandejas	Fisher Scientific	12-565-154	Los pasos de inmunotinción se realizan en esta bandeja
Parafilm	Fisher Scientific	S37440	Película utilizada para sellar placas con el fin de evitar la evaporación
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiódicos utilizados para prevenir la contaminación bacteriana de las células durante el cultivo.
Tampón de fosfato, pH7.4	Hecho en casa	Hecho en casa	Solvente utilizado para lavar los cerebros después de los pasos de fijación y tinción
Pick	Fine Science Tools	10140-01	Se utiliza para recoger larvas de la placa de uva
Ácido propiónico	Fisher Scientific	A-258	Plato de uva Ingredientes
Conejo 405	Abcam	ab175653	Anticuerpos utilizados para la inmunotinción
Rata 555	Abcam	ab150166	Anticuerpos utilizados para la inmunotinción
Rb Scribble	Un regalo de Chris Doe		Anticuerpos utilizados para la inmunotinción
Rt Deadpan	Abcam	ab195173	Anticuerpos utilizados para la inmunotinción
Schneiders Culture Medium Life	Tech 21720024		Contiene nutrientes que ayudan a las células a crecer y proliferar
SlowFade Diamond Antidecoloración (5 x 2 mL)	Life Tech	S36963	Reactivo que proporciona protección contra la decoloración de los fluoróforos
Autoclave de agua estéril	Agua Milli-Q hecha en casa		Necesario para soluciones
Sacarosa	Fisher	S2-12 Plato de	uva Ingredientes Portaobjetos
microscopio Superfrost Fisher	Scientific	12-544-7
Superglue	La mayoría de los supermercados
Tegosept	Genesee Scientific	20-259	Grape Plate Ingredientes
Triton-X 100	Sigma	T9284-100ML	PBT
Welch's 100% jugo de uva	mayoría de los supermercados		Ingredientes del plato de uva

Campana de de La