JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Syntese af Masarimycin, en lille molekylehæmmer af grampositiv bakterievækst

Published: January 07, 2022
doi:
10.3791/63191
, ,
1Department of Science and Technology,Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences,Bryant University

Summary

En detaljeret protokol præsenteres til fremstilling af det bakteriostatiske diamid masarimycin, en lille molekylesonde, der hæmmer væksten af Bacillus subtilis og Streptococcus pneumoniae ved at målrette cellevægnedbrydning. Dens anvendelse som en kemisk sonde er påvist i synergi / antagonisme assays og morfologiske undersøgelser med B. subtilis og S. pneumoniae.

Abstract

Peptidoglycan (PG) i bakteriernes cellevæg er en unik makromolekylær struktur, der giver form og beskyttelse mod det omgivende miljø. Centralt for at forstå cellevækst og -deling er viden om, hvordan PG-nedbrydning påvirker biosyntese og cellevægssamling. For nylig er den metaboliske mærkning af PG gennem introduktion af modificerede sukkerarter eller aminosyrer blevet rapporteret. Mens kemisk forhør af biosyntetiske trin med små molekylehæmmere er mulig, er kemiske biologiske værktøjer til at studere PG-nedbrydning af autolysiner underudviklede. Bakterielle autolysiner er en bred klasse af enzymer, der er involveret i den tæt koordinerede nedbrydning af PG. Her præsenteres en detaljeret protokol til fremstilling af en lille molekylesonde, masarimycin, som er en hæmmer af N-acetylglucosaminidase LytG i Bacillus subtilis og cellevægsmetabolisme i Streptococcus pneumoniae. Fremstilling af inhibitoren via mikrobølgeassisteret og klassisk organisk syntese tilvejebringes. Dens anvendelighed som et redskab til at studere gram-positiv fysiologi i biologiske assays præsenteres.

Introduction

Peptidoglycan (PG) er en mesh-lignende polymer, der afgrænser celleform og struktur i både Gram-positive og Gram-negative bakterier 1,2. Denne heteropolymer er en matrix af aminosukker, der er tværbundet af korte peptider 3,4,5,6 med en rygrad sammensat af β(1,4)-bundne vekslende N-acetylglucosamin (GlcNAc) og N-acetylmuraminsyre (MurNAc) rester (figur 1)1. Vedhæftet til C-3 lactyl moiety af MurNAc er stammepeptidet. Metabolismen af PG involverer et tæt koordineret system af biosyntetiske og nedbrydende enzymer til at inkorporere nyt materiale i cellevæggen 7,8. Nedbrydning af PG udføres af enzymer, der kollektivt betegnes som autolysiner9 og yderligere klassificeres baseret på specificiteten af den spaltede binding. Autolysiner deltager i mange cellulære processer, herunder cellevækst, celledeling, bevægelighed, PG-modning, kemotaxis, proteinsekretion, genetisk kompetence, differentiering og patogenicitet10,11. Unraveling de specifikke biologiske funktioner af individuelle autolysiner kan være skræmmende, delvis på grund af funktionel redundans. Nylige biofysiske 8,12,13 og beregningsmæssige undersøgelser12 har imidlertid givet ny indsigt i deres roller i PG-metabolisme. Derudover har nylige rapporter givet yderligere indsigt i syntesen14 og membranmedieret 15,16,17 trin i PG-metabolisme. En grundig forståelse af forholdet mellem nedbrydende og syntetiske veje for PG-metabolisme kan give anledning til tidligere uudnyttede antibiotikamål.

Mens der har været betydelige fremskridt i metodologi til undersøgelse af glykobiologi i eukaryoter, har bakteriel glykobiologi og især PG-metabolisme ikke udviklet sig med en lignende hastighed. Nuværende kemiske tilgange til undersøgelse af PG-metabolisme omfatter fluorescerende mærkede antibiotika18, fluorescerende sonder19,20 og metabolisk mærkning 21,22,23,24. Disse nye tilgange giver nye måder at forhøre bakteriel cellevægmetabolisme på. Mens nogle af disse strategier er i stand til at mærke PG in vivo, kan de være artsspecifikke19 eller kun arbejde i stammer, der mangler en bestemt autolysin25. Mange PG-mærkningsstrategier er beregnet til brug med isolerede cellevægge26 eller med in vitro-rekonstituerede PG-biosynteseveje 20,27,28. Anvendelsen af fluorescerende mærkede antibiotika er i øjeblikket begrænset til biosyntetiske trin og transpeptidering18.

Den nuværende viden om bakterielle autolysiner og deres rolle i cellevægsmetabolisme kommer fra genetisk og in vitro biokemisk analyse 11,29,30,31,32. Mens disse tilgange har givet et væld af oplysninger om denne vigtige klasse af enzymer, kan det være udfordrende at dechiffrere deres biologiske rolle. På grund af funktionel redundans33 resulterer sletning af en autolysin f.eks. i de fleste tilfælde ikke i at standse bakterievæksten. Dette er på trods af deres underforståede rolle i cellevækst og deling 7,12. En anden komplikation er, at genetisk deletion af bakterielle autolysiner kan give anledning til metafænotyper34. Metafænotyper opstår fra det komplekse samspil mellem den vej, der påvirkes af den genetiske deletion og andre indbyrdes forbundne veje. For eksempel kan en metafænotype opstå via en direkte effekt som manglen på et enzym eller en indirekte effekt såsom en forstyrrelse af regulatorer.

I øjeblikket er der kun få hæmmere af glycosidase autolysiner, såsom N-acetylglucosaminidaser (GlcNAcase) og N-acetylmuramidaser, som kan bruges som kemiske sonder til at studere nedbrydningen af PG. For at imødegå dette er diamidmasarimycin (tidligere betegnet som fgkc) blevet identificeret og karakteriseret35 som en bakteriostatisk hæmmer af Bacillus subtilis vækst, der er rettet mod GlcNAcase LytG32 (figur 1). LytG er en exo-virkende GlcNAcase36, et medlem af klynge 2 inden for glycosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Det er den største aktive GlcNAcase under vegetativ vækst32. Så vidt vi ved, er masarimycin den første hæmmer af en PG-virkende GlcNAcase, der hæmmer cellulær vækst. Yderligere undersøgelser af masarimycin med Streptococcus pneumoniae viste, at masarimycin sandsynligvis hæmmer cellevægsmetabolismen i denne organisme37. Her rapporteres fremstillingen af masarimycin til brug som kemisk biologisk sonde til undersøgelse af fysiologi i de grampositive organismer B. subtilis og S. pneumoniae. Eksempler på morfologisk analyse af sub-minimum hæmmende koncentrationsbehandling med masarimycin samt et synergi/antagonisme-assay præsenteres. Synergi og antagonisme assays ved hjælp af antibiotika med veldefinerede virkningsmåder kan være en nyttig måde at udforske forbindelser mellem cellulære processer 38,39,40.

Protocol

1. Generelle metoder BEMÆRK: Alle forbindelser blev købt hos standardleverandører og brugt uden yderligere rensning. Udfør tyndtlagskromatografi (TLC) på en aluminiumsplade forbelagt med silicagel XG F254. Registrer pletter under en UV-lampe, ved nedsænkning i p-anisaldehydplet eller ved at udsætte for I2-damp. Optag alle NMR-spektre (nuclear magnetic resonance) på et 400 MHz spektrometer.BEMÆRK: 1H-NMR og 13…

Representative Results

Masarimycin er et lille molekyle bakteriostatisk hæmmer af B. subtilis og S. pneumoniae og har vist sig at hæmme den exo-virkende GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 og målrette cellevæggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan fremstilles effektivt enten ved den klassiske eller mikrobølgeassisterede organiske syntese med udbytter i intervallet 55%-70%. Mikrobølgeassisteret syntese har fordelen ved en s…

Discussion

Masarimycin er en enkelt mikromolær bakteriostatisk hæmmer af B. subtilis35 og S. pneumoniae37 vækst. I B. subtilis har masarimycin vist sig at hæmme GlcNAcase LytG35, mens det præcise molekylære mål i cellevæggen hos S. pneumoniae ikke er blevet identificeret37. Syntese af masarimycin ved hjælp af enten den klassiske organiske syntese eller mikrobølgeprocedure giver hæmmeren i godt udbytt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forskningen blev støttet af National Science Foundation under bevillingsnummer 2009522. NMR-analyse af masarimycin blev støttet af National Science Foundation store forskningsinstrumenteringsprogramtildeling under bevillingsnummer 1919644. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.

Materials

2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -. V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -. H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Tags

MasarimycinGram-positive BacteriaAutolysin InhibitorBacterial Growth InhibitorOrganic SynthesisCyclohexylamineCyclohexyl CarboxaldehydeOrtho-iodobenzoic AcidCyclohexyl IsocyanideMethanolThin-layer ChromatographyEthyl AcetateHydrochloric AcidSodium BicarbonateSodium ChlorideSodium Sulfate
check_url/63191?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image