Denne protokol beskriver trinene til at generere en 3D-model af metabolitfordeling under trypanosomatidinfektion, herunder prøveindsamling, metabolitekstraktion, en oversigt over væskekromatografi-tandemmassespektrometri dataindsamling, 3D-modelgenerering og endelig datavisualisering.
Patogentropisme og sygdomstropisme refererer til vævsstederne selektivt koloniseret eller beskadiget af patogener, hvilket fører til lokaliserede sygdomssymptomer. Human-infektiøsive trypanosomatid parasitter indbefatter Trypanosoma cruzi, det forårsagende middel til Chagas sygdom; Trypanosoma brucei, det forårsagende middel til sovesyge; og Leishmania arter, forårsagende midler til leishmaniasis. Derfor påvirker de 20 millioner mennesker over hele kloden. Disse parasitter viser specifik tropisme: hjerte, spiserør, tyktarm til T. cruzi, fedtvæv, bugspytkirtel, hud, kredsløbssystem og centralnervesystem til T. brucei, hud til dermotrope Leishmania-stammer og lever, milt og knoglemarv til viscerotrope Leishmania-stammer . Et rumligt perspektiv er derfor afgørende for at forstå trypanosomatid sygdomspatogenese. Kemisk kartografi genererer 3D-visualiseringer af små molekyle overflod genereret via væskekromatografi-massespektrometri sammenlignet med mikrobiologiske og immunologiske parametre. Denne protokol viser, hvordan kemisk kartografi kan anvendes til at studere patogene processer under trypanosomatidinfektion, begyndende med systematisk vævsprøveudtagning og metabolitekstraktion efterfulgt af dataindsamling om væskekromatografi-tandemmassespektrometri og afsluttende med generering af 3D-kort over metabolitfordeling. Denne metode kan bruges til flere forskningsspørgsmål, såsom næringsbehov for vævskolonisering af T. cruzi, T. brucei eller Leishmania, immunmetabolisme på infektionssteder og forholdet mellem lokal vævsmetabolisk forstyrrelse og kliniske sygdomssymptomer, hvilket fører til omfattende indsigt i trypanosomatid sygdomspatogenese.
Trypanosomatid parasitter består af Leishmania arter, afrikanske trypanosomer (Trypanosoma brucei) og amerikanske trypanosomer (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoer forårsager leishmaniasis, som omfatter selvhelbredende og selvbegrænset lokaliseret kutan leishmaniasis, mukokutan leishmaniasis, hvor slimhindevævet i mund, næse og hals bliver beskadiget, og visceral leishmaniasis med parasittropisme til de viscerale organer, der forårsager feber og hepatosplenomegali1,2. T. brucei forårsager human afrikansk trypanosomiasis (HAT), også kendt som sovesyge, hovedsageligt rapporteret i afrikanske lande3. De kliniske tegn og symptomer omfatter hepatosplenomegali, feber, hovedpine, muskuloskeletale smerter, lymfadenopatier og anæmi i hæmolymfatisk stadium, når parasitter lokaliserer sig til blodbanen og lymfeknuder. Dette efterfølges af det meningo-encephalitiske stadium, hvor parasitter lokaliserer sig til centralnervesystemet og forårsager søvnforstyrrelse, adfærdsændring og til sidst dødelige komaer4. T. cruzi forårsager Chagas sygdom, endemisk i Amerika. Inficerede individer oplever et indledende akut stadium, normalt asymptomatisk, med bred parasittropisme. Omkring 10%-30% af de inficerede individer oplever kroniske stadium symptomer efter årtier med infektion, karakteriseret ved megaoesophagus, megacolon og kardiovaskulære komplikationer5,6.
Metabolomics studerer små molekylære arter (50-1.500 Da), herunder biologiske forbindelser fra primær eller sekundær metabolisme og eksternt afledte forbindelser såsom lægemidler eller fødevareafledte molekyler. I forbindelse med værtspatogeninteraktioner kan metabolomics undersøge infektionens indvirkning på værtsmetabolitmiljøer, hvilket er afgørende for at få adgang til patogenets virkning på værten. Det kan også vurdere patogentilpasninger til værtsns ernæringsmæssige og immunologiske miljø7,8,9. Massespektrometri (MS) og nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er almindelige metabolomics-værktøjer, der bruges til at identificere, kvantificere og karakterisere metabolitter. Denne “omics” tilgang kan også anvendes til biomarkøropdagelse og lægemiddeludvikling10,11.
I betragtning af den specifikke vævstropisme af trypanosomatidparasitter kan rumlige metabolomics-analyser muliggøre betydelig indsigt i patogenesen af de sygdomme, de forårsager. Kortlægning af den rumlige fordeling af metabolitter afslørede metabolitter lokalt påvirket af kronisk Trypanosoma cruzi-infektion i musehjertevæv og akut og langvarig Trypanosoma cruzi-infektion i musens mave-tarmkanalen6,12,13. Specifikt viste 3D-kemisk kartografi en afbrydelse mellem parasitesistens og metaboliske ændringer i hjertevævet hos kronisk Trypanosoma cruzi-inficerede mus. Metabolisme var mest forstyrret i nedre og apikale segmenter af hjertet, der matchede med steder af Chagas sygdom symptomer (hjerte apikale aneurismer). Metabolitfamilier forstyrret af infektion på specifikke hjertesteder og korreleret med sygdommens sværhedsgrad omfatter acylcarnitiner og glycerophosphocholiner12,13,14. I mave-tarmkanalen var vedvarende metaboliske ændringer i uenige med steder med Chagas sygdom symptomer: spiserør og tyktarm. I modsætning hertil normaliseres stofskiftet igen på steder, der ikke er forbundet med Chagas sygdomssymptomer, såsom tyndtarmen. Metabolitter lokalt forstyrret af infektion i mave-tarmkanalen omfatter acylcarnitiner, glycerophosphocholiner, kynurenin, tryptophan og cholsyre. Desuden gjorde disse analyser det muligt at identificere en ny metabolisk mekanisme for tolerance over for Chagas sygdom6. Anvendelse af disse metoder til undersøgelse af kutan leishmaniasis afslørede signifikante metaboliske forstyrrelser på læsionsstedet, men også specifikke metaboliske ændringer i læsionstilstødende, makroskopisk sundt væv. For eksempel blev glutamin udtømt på læsionsstedet, mens glycerophosphocholiner i m / z (masse til ladningsforhold) 200-299, 400-499, 500-599 og 600-699 blev signifikant øget på læsionsstedet. PC (O-34:1) blev kun øget på læsions-tilstødende steder15.
Målet med dette manuskript er at demonstrere de trin, der er nødvendige for at generere 3D-modeller af metabolitfordeling (“kemisk kartografi”) som anvendt på trypanosomatidparasitinfektionsmodeller (figur 1). Denne tilgang bygger på flere kritiske fremskridt i forbindelse med metabolomics og metabolomics databehandling, især udviklingen af ‘ili-software til let at plotte metabolomics-data på 3D-modeller16.
Forståelse af trypanosomatidinfektioner er afgørende for at guide nye lægemiddeludviklings- og behandlingsmetoder. Denne kemiske kartografimetode er unikt klar til at give handlingsrettet indsigt i forholdet mellem metabolisme og trypanosomatid sygdomspatogenese og dermed imødekomme dette translationelle behov.
Kun opløsningsmidler af LC-MS-kvalitet anbefales under metabolitekstraktion og MS-analyser for at mindske baggrundsforurening. Polymerkontaminering35, der almindeligvis stammer fra paraffinfilm og/eller anden plast36,37,38, skal så muligt undgås. Især parafilm må aldrig bruges. Disse aspekter er afgørende, da LC-MS-datakvaliteten afhænger af de materialer, der anvendes under prøveforberedelse og metabolitekstraktion. Datakvaliteten bør sikres, inden der genereres »ili-plots«. Desuden kræver generering af disse omfattende rumlige metabolomics-kort indsamling af alle tilstødende vævsprøver og metabolitekstraktion fra alle indsamlede prøver for at undgå huller i disse kort. Indsamlingsprocedurer, logistik i forbindelse med metabolitekstraktion og LC-MS-analyse samt omkostninger bør derfor overvejes og planlægges i overensstemmelse hermed.
Denne protokol kan ændres for at imødekomme brugernes behov på flere måder. For eksempel vil polariteten og opløseligheden af opløsningsmidler, der anvendes under metabolitekstraktion, påvirke, hvilke metabolitter der påvises39. For at maksimere mangfoldigheden af påviste metabolitegenskaber til ikke-målrettede kemiske kartografianalyser anbefales det at kombinere flere ekstraktionstrin og opløsningsmidler. For eksempel anvender denne metode dichlormethan, methanol og vand som ekstraktionsmidler, fordi de muliggør nøjagtig påvisning af ikke-polære og polære molekyler20,40. Disse opløsningsmidler er imidlertid ikke universelt egnede til hvert MS-eksperiment, og forskere bør vælge ekstraktionsopløsningsmidler baseret på målene for deres projekt. Ligeledes kan forskellige LC-MS/MS-betingelser anvendes, såsom udskiftning af omvendt fasekromatografi med normal fasekromatografi. Alternative kolonner kan også bruges til omvendt fase dataindsamling i stedet for C8-kromatografi, selvom C8-kromatografi empirisk er mere robust over for vævslipider og har en lavere tilstopningsfrekvens. Konceptuelt kan disse protokoller også anvendes på andre massespektrometrimetoder såsom gaskromatografi-massespektrometri osv.
En alternativ tilgang er massespektrometribilleddannelse. I modsætning til massespektrometribilleddannelsesmetoder bevarer væskekromatografi-massespektrometri ikke i sig selv rumlig information10. Kemisk kartografi tilgange bygger bro over dette hul ved at inkludere prøveudtagningssted på tidspunktet for projektkonceptualisering, i prøvemetadataene og ved databehandlingstrin. En styrke ved denne kemiske kartografitilgang, i modsætning til massespektrometribilleddannelse, er evnen til at give selvsikre kommentarer (Metabolomics Standards Initiative niveau 1 eller niveau 2 annotationstillid41), i modsætning til massespektrometribilleddannelse, hvor størstedelen af applikationerne kun er afhængige af nøjagtig masse til anmærkning. Massespektrometribilleddannelse muliggør finkornet rumlig kortlægning, nogle gange ned til enkeltcelleniveau, f.eks. 42,43. I modsætning hertil muliggør kemisk kartografitilgange storstilet kortlægning på tværs af organer af metabolitfordeling uden at kræve højt specialiserede kryosektionsfærdigheder for hele dyr. Kemisk kartografi giver supplerende dokumentation for de mange rumlige transkriptomiske tilgange, der udvikles, f.eks. 44, med den fordel, at der fokuseres på ‘omics-laget tættest på fænotypen’45. Alternative metoder til kvantificering af parasitbelastning omfatter måling af bioluminescens på tidspunktet for prøveindsamling6. Fine segmenter kan også indsamles for at muliggøre konfokal eller elektronmikroskopi for at vurdere lokaliseret parasitbyrde og vævsskade. Vandhomogenatet, som anvendes til cytokinkvantificering i denne protokol og tidligere publikationer13, kan også bruges til at kvantificere proteinbaserede markører for vævsskade.
Der er også flere måder at få 3D-modeller, der er egnede til at plotte de resulterende LC-MS-data. Ud over den metode, der foreslås her, kan modeller købes forudfremstillet fra forskellige online leverandører. Sørg for, at vilkårene for brug stemmer overens med den tilsigtede brug, især med hensyn til offentliggørelse. Modeller til store organer kan genereres de novo ved hjælp af 3D-scannere i henhold til scannerinstruktionerne. Der findes alternativer som MATLAB til generering og visualisering af 3D-modeller til kemisk kartografi46, men de blev primært implementeret før udviklingen af ‘ili16. MATLAB er en dataanalyse- og programmeringsværktøjspakke, der tilbyder en bred vifte af applikationer på tværs af mange områder. MATLAB er dog hverken gratis eller open source, og det kræver kendskab til MATLAB-grænseflader, især i betragtning af at MATLAB ikke blev udviklet til behandling af massespektrometridata. Denne foreslåede metodes alternativer, nemlig SketchUp, Meshlab og ‘ili, er frit tilgængelige, brugervenlige og tilbyder lignende funktioner som MATLAB til kemiske kartografiformål.
Denne metode er robust med hensyn til prøveforberedelse og metabolitekstraktion. Fejlfinding er oftest nødvendig på LC-MS-dataindsamlingstrinnet. Dette ligger uden for denne artikels anvendelsesområde. Læsere ledes til fremragende publikationer om fejlfinding af LC-MS-dataindsamling, herunder 20,47. Ligeledes er kompleksiteten af metabolitannotation uden for rammerne af denne metodes fokus på 3D-modelgenerering. Nyttige referencer om dette emne omfatter24,25,48,49.
Mens denne metode effektivt udforsker sygdomspatogenese, er der begrænsninger for denne tilgang, hvoraf nogle er almindelige på tværs af ethvert metabolomics-eksperiment. En sådan begrænsning er den lave annotationsrate for LC-MS-funktioner50, som er betinget af referencespektralbibliotekernes tilgængelighed og kvalitet. En yderligere begrænsning er, at denne protokol ikke bevarer mRNA på grund af uforeneligheden af RNA-konserveringsreagenser såsom RNAlater med LC-MS / MS-analyse. Proteinkvaliteten er dog tilstrækkelig til downstream-analyser og kan dermed erstatte mRNA-baserede analyser.
En kemisk kartografi tilgang til infektionspatogenese afspejler direkte, hvordan bakterielle, virale eller parasitære infektioner udvikler sig i organsystemer og forårsager lokaliseret sygdom. Analyse af disse regionale delprøveudsampler og generering af 3D-modeller formidler i sidste ende, hvordan metabolitter fungerer på tværs af tredimensionelt rum og kaster lys over disse tidligere ukendte rumlige dimensioner af molekylærbiologi. Ved hjælp af denne protokol blev metabolitlokalisering for eksempel sammenlignet med Trypanosoma cruzi parasitbelastning. Resultaterne afklarede forholdet mellem patogenet og værtsvævet og demonstrerede også den metaboliske dynamik i Chagas sygdom symptom progression6. Kemiske kartografimetoder er også blevet anvendt på forskellige emner, såsom menneskebygget miljøinteraktion51,52,53, den kemiske sammensætning af organsystemer som menneskelig hud46 og lunger54 og plantemetabolisme og miljøinteraktioner55. Fremtidige anvendelser kan involvere vurdering af lokaliseret sygdomstolerance og modstandsdygtighed eller forholdet mellem lokale metabolitniveauer, patogentropisme og sygdomstropisme i modeller ud over trypanosomatidinfektion. Denne tilgang bør også have bred anvendelighed til at udvide de nuværende farmakokinetiske protokoller, til at vurdere forholdet mellem lokale vævslægemiddelniveauer og lægemiddelmetabolisme i forhold til den samlede metaboliske kontekst, vævsskade og patogenclearance. Samlet set tillader kemisk kartografi unikke udforskninger af metabolitfordelinger i forskellige prøvetyper med anvendelser, herunder sygdomspatogenese, menneskers sundhed, interaktioner mellem mennesker og miljø og mikrobiel dynamik.
The authors have nothing to disclose.
Laura-Isobel McCall, ph.d., har en Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Award fra Burroughs Wellcome Fund. Forfatterne ønsker endvidere at anerkende støtte fra NIH-prisnummer R21AI148886, et pilottilskud fra Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) under NIH-tildelingsnummer P20GM103648 og opstartsmidler fra University of Oklahoma (til LIM). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis bidragydernes officielle synspunkter. Forfatterne ønsker også at takke udviklerne af de værktøjer, der bruges i denne protokol. Alle relevante publikationer er blevet citeret, hvor det er relevant.
1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
96 well plate | Fisher | 3252449 | |
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
dry ice | NA | NA | any brand, as available |
extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
fume hood | NA | NA | any brand, as available |
high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
ili software | ili.embl.de | NA | |
isoflurane | Covetrus | 29405 | |
large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
Q-Plex Mouse Cytokine – Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
wet ice | NA | NA | any brand, as available |
zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |