बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित डीएसआरएनए का मौखिक प्रशासन, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के लिए एक वितरण विधि जो नियमित रूप से केनोरहाबिडिटिस एलिगेंस में उपयोग की जाती है, यहां वयस्क मच्छरों पर सफलतापूर्वक लागू की गई थी। हमारी विधि इंजेक्शन के उपयोग के बिना मजबूत रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययन और संचरण-अवरुद्ध वेक्टर अध्ययन के लिए अनुमति देती है।
आरएनए हस्तक्षेप दो दशकों के लिए रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक भारी उपयोग किया जाने वाला उपकरण रहा है। वयस्क मच्छरों में, डबल-फंसे हुए आरएनए (डीएसआरएनए) प्रशासन को मुख्य रूप से इंजेक्शन के माध्यम से पूरा किया गया है, जिसके लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता होती है और क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यहां हम वयस्क एनोफिल्स गाम्बिया को डीएसआरएनए के मौखिक वितरण द्वारा आरएनएआई के मजबूत सक्रियण के लिए एक अधिक कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं। लंबे dsRNAs Escherichia कोलाई तनाव HT115 (DE3) में उत्पादित किया गया था, और 10% सुक्रोज में गर्मी से मारे गए dsRNA युक्त बैक्टीरिया का एक केंद्रित निलंबन कपास गेंदों पर वयस्क मच्छरों के लिए विज्ञापन-libitum की पेशकश की गई थी। कपास की गेंदों को उपचार की अवधि के लिए हर 2 दिनों में बदल दिया गया था। डबल्सेक्स (सेक्स भेदभाव में शामिल एक जीन) या कांटा सिर (जो लार ग्रंथि प्रतिलेखन कारक को एन्कोड करता है) को लक्षित करने के लिए इस विधि का उपयोग करने के परिणामस्वरूप क्रमशः मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) या प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है, जैसा कि क्रमशः मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) या प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है। लार ग्रंथि आकृति विज्ञान में दोष भी देखे गए थे। यह अत्यधिक लचीला, उपयोगकर्ता के अनुकूल, कम लागत, dsRNA वितरण के समय-कुशल तरीका मोटे तौर पर कीट वेक्टर फिजियोलॉजी और उससे परे के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य जीन पर लागू हो सकता है।
मच्छरों द्वारा कई बीमारियां फैलती हैं, जिससे मच्छर शरीर विज्ञान और आनुवंशिकी का अध्ययन एक महत्वपूर्ण उपक्रम बन जाता है। इन जीवों में आरएनएआई का उपयोग पिछले 20 वर्षों में प्रमुख रहा है और कई मच्छर जीनों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी गई है 1,2,3,4,5। DSRNA वितरण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक माइक्रोइंजेक्शन रही है, जिसमें कमियां हैं कि यह मच्छरों को घायल कर सकती है और इसके लिए महत्वपूर्ण समय और प्रयास की आवश्यकता होती है। आरएनएआई के लिए मौखिक वितरण विधियों का परीक्षण किया गया है, लेकिन मुख्य रूप से मच्छरों के लार्वा चरण में 6,7,8,9। वयस्क मच्छरों में dsRNA के मौखिक वितरण का पूरी तरह से पता नहीं लगाया गया है और वेक्टर जीव विज्ञान और वेक्टर नियंत्रण के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।
मलेरिया एनोफिलीज मच्छरों द्वारा प्रेषित किया जाता है जब एक संक्रमित मादा मच्छर एक असंक्रमित मेजबान से रक्त भोजन लेती है और मलेरिया परजीवीयुक्त लार इंजेक्ट करती है। अंततः एक मच्छर की लार में प्रेषित होने के लिए, परजीवी को कई बाधाओं को दूर करना चाहिए, जिसमें मच्छर प्रतिरक्षा प्रणाली से बचना, मिडगट बाधा का ट्रैवर्सल, और लार ग्रंथियों का आक्रमणशामिल है। मच्छर लार ग्रंथि (एसजी) वास्तुकला परजीवी आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है और यह वास्तुकला प्रमुख लार ग्रंथि-व्यक्त प्रतिलेखन कारकों के साथ-साथ यौन द्विरूपता के निर्धारकों दोनों द्वारा नियंत्रित की जाती है। लार ग्रंथियों के सेलुलर विनिर्देश और होमोस्टेटिक रखरखाव के लिए और लार प्रोटीन के उत्पादन और स्राव के लिए कई अत्यधिक संरक्षित प्रतिलेखन कारकों की आवश्यकता होती है जो रक्त-आहार 12,13,14 में कार्य करते हैं। फोर्क हेड (एफकेएच) एक पंखों वाला हेलिक्स प्रतिलेखन कारक है जो कीट एसजी संरचना और कार्य के एक प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करता है (फल मक्खियों और रेशम कीट कीट में अध्ययन के आधार पर)15,16,17,18,19,20। ड्रोसोफिला एसजी में, एफकेएच ऋषि के साथ कार्य करता है, एक एसजी-विशिष्ट बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (बीएचएलएच) प्रतिलेखन कारक, एसजी अस्तित्व और लार उत्पादन को बढ़ावा देनेके लिए 19। ड्रोसोफिला में लार उत्पादन का एक महत्वपूर्ण, सकारात्मक सह-नियामक क्रेबा है, जो एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया ल्यूसीन जिपर ट्रांसक्रिप्शन कारक है जो स्रावी मार्ग जीन21,22,23 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। मादा लार ग्रंथियों में रूपात्मक भेदभाव की एक मजबूत डिग्री भी है जो संभवतः एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, न केवल रक्त-भोजन में, बल्कि इस ऊतकपर आक्रमण करने के लिए परजीवियों की क्षमता में भी।
लार ग्रंथि अस्तित्व, संरचना, शरीर विज्ञान, और यौन द्विरूपता को निर्धारित करने में शामिल जीनों में से कई में जटिल स्पैटिओटेम्पोरल अभिव्यक्ति प्रोफाइल 25,26,27 है, और आरएनएआई को प्रेरित करने के लिए डीएसआरएनए के पारंपरिक वितरण के तरीके हमेशा इस या अन्य ऊतकों में इन प्रकार के जीनों को लक्षित करने में कुशल नहीं होते हैं। हालांकि, लार्वा चरण एडीज एजिप्टी और एन गैम्बियाई मच्छरों में डीएसआरएनए के मौखिक वितरण का उपयोग डीएसएक्स जीन 9,28 के मादा-विशिष्ट रूप को चुप करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। मच्छर लार ग्रंथियों में dsRNA का उपयोग करके पिछले अध्ययनों में पाया गया कि, हालांकि बड़ी मात्रा में dsRNA की आवश्यकता थी, मौन प्रभाव अपेक्षाकृत लंबे समय तक चलने वाला था (कम से कम 13 दिन)29। यहां, वयस्क मादा मच्छरों में इन जीनों के आरएनएआई को शांत करने के लिए डीएसएक्स, एफकेएच, या क्रेबा के लिए अनुक्रम-विशिष्ट डीएसआरएनए व्यक्त करने वाले गर्मी से मारे गए ई कोलाई स्ट्रेन एचटी 115 (डीई 3) की क्षमता का परीक्षण किया गया था। DSRNA प्रेरित जीन नॉकडाउन का मौखिक प्रशासन An. gambiae में, mRNA के स्तर में स्पष्ट कटौती के साथ और इन जीनों के नुकसान के कार्य के अनुरूप फेनोटाइप के साथ। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण संभवतः विभिन्न प्रकार के लार ग्रंथि जीन के कार्य को खटखटाने के लिए काम करेगा।
मौखिक भोजन द्वारा एक गाम्बियाई मच्छरों को प्रभावी ढंग से डीएसआरएनए वितरित करने की क्षमता प्रयोगशाला और क्षेत्र दोनों में वेक्टर जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए व्यापक निहितार्थ है। माइक्रोइंजेक्शन को लंबे समय से रसायनों, एंटीबॉडी, आरएनएआई और मच्छरों में आनुवंशिक संशोधन रणनीतियों के वितरण के पसंदीदा मोड के रूप में स्वीकार किया गया है 43,44। पर्याप्त शारीरिक हेरफेर, सेलुलर क्षति और तनाव के परिणाम को मौखिक वितरण के उपयोग से टाला जा सकता है, जो बड़े पैमाने पर या क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए संभावित रूप से उपयुक्त हो सकता है। पिछले काम ने सुझाव दिया है कि आरएनएआई एक व्यक्तिगत वयस्क मच्छर29 के भीतर सर्वव्यापी रूप से कार्य करता है, जिससे लार ग्रंथियों सहित सभी ऊतकों में प्रभाव पड़ता है। बड़ी संख्या में डीएसआरएनए-व्यक्त ई कोलाई के साथ मच्छरों को खिलाकर जो एक लंबी समय सीमा में अतुल्यकालिक रूप से पच जाते हैं, कोई संभावित रूप से पिंजरे में सभी व्यक्तियों में आरएनएआई के लिए सुसंगत और समान जोखिम प्राप्त कर सकता है। यह विधि बड़ी संख्या में मच्छरों को खिलाने और लक्ष्य जीन के आधार पर परिणामी फेनोटाइप की संभावित परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण विचार बैक्टीरिया के विषम वितरण की संभावना है, और इसलिए कपास फाइबर में डीएसआरएनए। मच्छर चीनी-फीडिंग के लिए दैनिक रूप से उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया के 400 μL में लगभग ≤4.6 μg dsRNA होगा, जैसा कि पहले वर्णित और गणना की गईथी 9 लेकिन प्रत्येक मच्छर द्वारा निगला गया dsRNA की मात्रा व्यक्तिगत रूप से निर्धारित नहीं की गई थी। यदि dsRNA निर्माण नियमित हो जाता है, तो यह सरल उपचार प्रोटोकॉल किसी भी मच्छर शोधकर्ता द्वारा इस तकनीक के तेजी से आत्मसात करने की अनुमति देता है। एक प्राथमिकता, उपचार के दौरान समय व्यय (प्रति दिन 30 मिनट) सीखने और समान नमूना आकारों के लिए माइक्रोइंजेक्शन लागू करने में लगने वाले समय की तुलना में तुच्छ है।
डीएसआरएनए को खिलाने का उपयोग नियमित रूप से मॉडल जीव Caenorhabditis elegans45 में रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययन के लिए किया जाता है। उपयोग का यह भारी स्तर मौखिक वितरण दृष्टिकोण के मूल्य को रेखांकित करता है। परिवर्तित ई कोलाई में एक ए. गाम्बिया जीनोम-वाइड लाइब्रेरी का निर्माण, जो सी. एलिगेंस46,47 में मौजूद है, के समान, बढ़े हुए पैमाने पर मच्छरों में तेजी से रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीनिंग की अनुमति देगा। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विधि की दक्षता प्रतिलेख के अंतर्जात स्तरों पर बहुत अधिक निर्भर करती है और यदि अभिव्यक्ति लक्ष्य ऊतक तक सीमित नहीं है, लेकिन अधिक व्यापक रूप से4,8,44 व्यक्त की गई है। इसके अतिरिक्त, इस बात के सबूत हैं कि कुछ कीटनाशक मच्छरों से व्यवहारिक परिहार को प्रेरित कर सकते हैं48, और बैक्टीरिया के साथ खिलाना जो संभावित रूप से उनमें प्रतिकूल प्रभाव पैदा करते हैं, परिहार के समान पैटर्न को ट्रिगर कर सकते हैं। प्रयोगशाला की नियंत्रित सेटिंग में, जहां मच्छरों के पास एक वैकल्पिक खाद्य स्रोत नहीं था, उनके पास ई कोलाई के साथ चीनी पानी से बचने का विकल्प नहीं था और एक पौष्टिक स्रोत की आवश्यकता शायद बैक्टीरिया से बचने के लिए वृत्ति को ओवरराइड करेगी। हालांकि, इस पर विचार किया जाना चाहिए यदि रणनीति का उपयोग कम नियंत्रित सेटिंग्स में किया जाना था।
एक साथ कई जीनों को लक्षित करना संभव हो सकता है (एक निर्माण, कई निर्माणों, या परिवर्तित जीवाणु आइसोलेट्स के मिश्रण का उपयोग करके), लेकिन प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इस बिंदु के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार एकल या एकाधिक लक्ष्यों का उपयोग करते समय संभावित ऑफ-टारगेट या सहक्रियात्मक प्रभावों का मूल्यांकन है। उपयुक्त नियंत्रण जीन और समूहों की स्थापना प्रयोगात्मक डिजाइन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। इसके अलावा, यह अनुमान लगाने के लिए मोहक है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग अन्य रोगजनकों या वायरस को लक्षित करने के लिए किया जा सकताहै। मच्छरों में आरएनएआई प्रेरण की ओर पिछला काम उन परिस्थितियों में किया गया था जहां अभिकर्मक को सीधे इंजेक्ट किया गया था, इसलिए ई कोलाई मौजूद नहीं थे। ई कोलाई एक सुरक्षात्मक डिब्बे प्रदान कर सकता है जो समय के साथ डीएसआरएनए की धीमी रिहाई के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करता है कि एक्सपोजर बहुत लंबी अवधिमें कम या ज्यादा निरंतर है।
अंत में, इन परिणामों से पता चलता है कि इस तकनीक के प्रभाव एक्सपोजर के समय सीमा (लंबाई और शुरुआती दिन) और उपयोग किए जाने वाले ई कोलाई की मात्रा को समायोजित करके ट्यूनेबल हैं। इस सुविधा ने हमें परीक्षण और त्रुटि द्वारा इष्टतम नॉकडाउन स्थितियों की पहचान करके आवश्यक जीन (डीएसएक्स और एफकेएच) के कार्यों का अध्ययन करने की अनुमति दी। यह इस संभावना को बहुत बढ़ाता है कि इस तकनीक का उपयोग करके ब्याज के लक्षित जीन की जांच की जा सकती है।
संक्षेप में, यह पाया गया कि वयस्क मच्छरों के लिए आरएनएआई का मौखिक वितरण सरल, बहुमुखी और मच्छर जीन समारोह का अध्ययन करने और मच्छर जनित बीमारियों के वेक्टर नियंत्रण के लिए उपन्यास और निंदनीय उपकरणों के निर्माण के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को कीट विज्ञान शाखा और सीडीसी में परजीवी रोगों और मलेरिया के प्रभाग के भीतर कर्मचारियों और वैज्ञानिकों को धन्यवाद देना चाहते हैं, और ब्रायन ट्रिग और मिशेल चिउ जेएचयू में बैक्टीरिया की तैयारी और / या इस काम की सहायक चर्चाओं के साथ सहायता के लिए। हम जेएचएमआरआई कीटरी और प्रबंधक क्रिस किजिटो को एन गाम्बियाई मच्छरों तक पहुंचने और पालने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम इस अध्ययन में उपयोग के लिए प्लास्मिड PJet GFP और pPB47 GFP प्राप्त करने में सहायता के लिए वेई हुआंग (JHSPH) को धन्यवाद देते हैं। इस काम के लिए धन द्वारा प्रदान किया गया था: एनआईएच R21AI153588 (DJA के लिए), एक जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (मेगावाट के लिए); और गुड वेंचर्स फाउंडेशन और ओपन परोपकार परियोजना से सीडीसी फाउंडेशन को अनुदान द्वारा मलेरिया के लिए अनुसंधान में सहायता के लिए मच्छरों में महिला विकास का समर्थन क्रायोप्रिजर्वेशन और दमन, ओपन परोपकार परियोजना, 2017 शीर्षक दिया गया है। हम गहराई से JHU माइक्रोस्कोप सुविधा कर्मचारियों से सहायता और उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप के लिए लागू एनआईएच अनुदान समर्थन की सराहना करते हैं (एनआईएच ग्रांट #: S10OD016374)। इस पांडुलिपि में निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखकों के हैं और जरूरी नहीं कि सीडीसी के विचारों का प्रतिनिधित्व करें। व्यापार नामों का उपयोग केवल पहचान के लिए है और इसका मतलब रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र, सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा, या अमेरिकी स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा समर्थन नहीं है।
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
BugDorm | BioQuip | 1452 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Damiens diet | BioServ | ||
DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
pGEMT easy | Promega | A3600 | |
Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
ANTIBODIES | |||
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
PRIMERS | |||
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |