Isolering och karakterisering av intakt fycobilisome i Cyanobakterier
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver isoleringen av fycobilisomer från cyanobakterier genom centrifugering genom en diskontinuerlig sackarostäthetsgradient. Fraktionerna av intakta fycobilisomer bekräftas av 77K fluorescerande emissionsspektrum och SDS-PAGE analys. De resulterande fycobilisome fraktionerna är lämpliga för negativ färgning av TEM och masspektrometri analys.
Abstract
I cyanobakterier är phycobilisome ett vitalt antennproteinkomplex som skördar ljus och överför energi till fotosystem I och II för fotokemi. Att studera strukturen och sammansättningen av phycobilisome är av stort intresse för forskare eftersom det avslöjar utvecklingen och divergensen av fotosyntes i cyanobakterier. Detta protokoll ger en detaljerad och optimerad metod för att bryta cyanobakterieceller till låg kostnad med en pärlslagare effektivt. Den intakta fycobilisomen kan sedan isoleras från cellextraktet genom sackarogradient ultracentrifugation. Denna metod har visat sig vara lämplig för både modell och icke-modell cyanobakterier med olika celltyper. Ett steg-för-steg-förfarande tillhandahålls också för att bekräfta integriteten och egenskapen hos fycobiliproteiner genom 77K fluorescensspektroskopi och SDS-PAGE färgade av zinksulfat och Coomassie Blue. Den isolerade fycobilisome kan också utsättas för ytterligare strukturella och sammansättning analyser. Sammantaget ger detta protokoll en användbar startguide som gör det möjligt för forskare som inte känner till cyanobakterier att snabbt isolera och karakterisera intakt fycobilisome.
Introduction
Phycobilisome (PBS) är ett stort vattenlösligt pigmentproteinkomplex som fäster vid fotosystemens cytoplasmiska sida i de thylakoida membranen i cyanobakterier1. PBS består främst av färgade fykobiliproteiner och färglösa länkproteiner1,2. Fycobiliproteinerna kan delas in i fyra stora grupper: fycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin och allophycocyanin3. De fyra stora grupperna absorberar olika våglängder av ljusenergi i intervallet 490-650 nm, som klorofyller absorberade ineffektivt3. PBS kan fungera som en ljusskördande antenn för att samla in ljusenergi och leverera den till Photosystem II och I4.
PBS struktur och sammansättning varierar från art till art. Tillsammans har tre former av fycobilisome (hemidiscodial, buntformad och stavformad) identifierats i olika cyanobakteriearter5. Även i samma art förändras sammansättningen av PBS som svar på miljön, såsom ljuskvalitet och näringsbrist6,7,8,9,10,11. Därför har det experimentella förfarandet för att isolera PBS från cyanobakterier varit avgörande för att studera PBS12. Under flera årtionden har många olika protokoll isolerat PBS och analyserat dess struktur, sammansättning och funktion6,7,8,12,13,14,15,16,17. Det stora utbudet av metoder för PBS-isolering ger verkligen flexibilitet när det gäller att isolera komplexet hos olika arter med olika reagenser och instrument. Men det gör det också svårare att välja ett lämpligt protokoll för forskare som inte känner till cyanobakterier och PBS. Därför utvecklas ett generaliserat och enkelt protokoll i detta arbete för dem som är intresserade av att starta PBS isolering från cyanobakterier.
Metoderna för att isolera PBS från tidigare publikationer sammanfattas här. Eftersom PBS är ett vattenlösligt proteinkomplex och lätt är dissocierat krävs en hög jonstyrka fosfatbuffert för att stabilisera PBS under extraktion18. Flera forskningsartiklar som beskriver metoder för isolering av PBS från cyanobakterier har publicerats tidigare. De flesta av metoderna kräver en hög koncentration av fosfatbuffert8,14,15,18,19. Förfarandena för mekanisk störning av cellerna varierar dock, såsom glas pärlor-assisterad extraktion, ultraljudsbehandling20 och franska press6,8,14. Olika fycobiliproteiner kan erhållas genom utfällning med ammoniumsulfat20 och renas av HPLC21 eller en kromatografisk kolumn22. Å andra sidan kan intakt PBS enkelt isoleras genom sackarosdensitetsgradient ultracentrifugation6,8,15.
I detta protokoll användes en modell cyanobacterium och en icke-modell cyanobacterium som material för PBS isolering. De är modell encelliga glukostoleranta Synechocystis sp. PCC 6803 (nedan syn6803) och icke-modell filamentösa Leptolyngbya sp. JSC-1 (nedan kallad JSC-1), respektive7,23,24. Protokollet börjar med störningar av den encelliga och filamentösa cyanobakterierna i en hög jonstyrka fosfatbuffert. Efter lys samlas supernatanterna upp genom centrifugering och behandlas sedan med ett icke-joniskt tvättmedel (Triton X-100) för att solubilisera de vattenlösliga proteinerna från thylakoidmembranen. De totala vattenlösliga proteinerna appliceras på en diskontinuerlig sackarostäthetsgradient för att fraktionera PBS. Den diskontinuerade sackaros gradienten i detta protokoll består av fyra sackaroslösningar och skiljeväggar den intakta PBS i de lägsta fraktionerna av sackarosskikt25. Integriteten hos PBS kan analyseras av SDS-PAGE, zinkfärgning och 77K fluorescensspektroskopi6,7,8,26. Denna metod är lämplig för forskare som syftar till att isolera intakt PBS från cyanobakterier och studera dess spektral-, struktur- och kompositionsegenskaper.
Det finns flera fördelar med detta protokoll. (1) Denna metod är standardiserad och kan användas för att isolera intakt PBS från både encelliga och filamentösa cyanobakterier. De flesta av artiklarna beskriver den metod som tillämpades i endera en typ av cyanobakterier4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Denna metod utförs vid rumstemperatur, eftersom PBS separerar vid låg temperatur19,27. (3) Denna metod beskriver användning av en pärlvissla för att störa cellerna. Därför är det billigare och säkrare än högtrycks fransk press och eventuella hörselskador från sonicator i andra metoder8,13,14,20. (4) Denna metod isolerar intakt PBS genom sackarogradient ultracentrifugering. På detta sätt kan intakt PBS med olika storlekar och delvis dissocierad PBS separeras baserat på sackaroskoncentration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en enkel och standard metod för att isolera intakt PBS i två typer av cyanobakterier, encellig modell Syn6803 och filamentös icke-modell JSC-1. De kritiska stegen i protokollet är cell homogenisering och ultracentrifugation på en diskontinuerlig densitet gradient av sackaros. I allmänhet är störningen av filamentösa celler mer komplicerad än encelliga. Öka mängden av utgångsmaterialet (cellpelletens våtvikt) och upprepningen av pärlslagning var till hjälp för att öka utbytet av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University för bekväm användning av ultracentrifuge. De cyanobakterie stammar synechocystis sp. PCC 6803 och Leptolyngbya sp. JSC-1 var begåvade från Dr. Chu, Hsiu-An vid Academia Sinica, Taiwan, och Dr. Donald A. Bryant vid Pennsylvania State University, USA, respektive. Detta arbete finansierades av ministeriet för vetenskap och teknik (Taiwan) (109-2636-B-002-013- och 110-2628-B-002-065-) och utbildningsministeriet (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 och 110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).
- Glazer, A. N. Light harvesting by phycobilisomes. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. . Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris – A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
