Spatiotemporal Subcellular हेरफेर सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन में जीवित प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण में फोटोस्टैटिन का उपयोग करके
Summary
विशिष्ट सूक्ष्मनलिकाएं अवरोधक, जो बुनियादी और लागू अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, कोशिकाओं पर दूरगामी प्रभाव डालते हैं। हाल ही में, फोटोस्टेटिन फोटोस्विचेबल माइक्रोट्यूबुल इनहिबिटर के एक वर्ग के रूप में उभरा, जो सूक्ष्मनलिकाएं के तात्कालिक, प्रतिवर्ती, स्पैटिओटेम्पोरल रूप से सटीक हेरफेर में सक्षम है। यह चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल एक 3 डी लाइव प्रीइंप्लांटेशन माउस भ्रूण में फोटोस्टैटिन के आवेदन का विवरण देता है।
Abstract
सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन एक सेल की रूपरेखा बनाती हैं और इंट्रासेल्युलर परिवहन, सेल विभाजन और सिग्नल ट्रांसडक्शन के लिए मौलिक हैं। उदाहरण के लिए, सर्वव्यापी सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क के पारंपरिक औषधीय विघटन का उपयोग करके, नोकोडाज़ोल किसी भी सेल के लिए विनाशकारी परिणाम हो सकता है। प्रतिवर्ती फोटोस्विचेबल सूक्ष्मनलिकाएं अवरोधकों में दवा के प्रभावों को सक्षम करके सीमाओं को दूर करने की क्षमता होती है, जिसे स्पैटिओटेम्पोरली-नियंत्रित तरीके से लागू किया जा सकता है। दवाओं का ऐसा ही एक परिवार एज़ोबेंजीन-आधारित फोटोस्टेटिन (पीएसटी) है। ये यौगिक अंधेरे परिस्थितियों में निष्क्रिय होते हैं, और यूवी प्रकाश के साथ रोशनी पर, वे β-ट्यूबुलिन की कोल्चिसिन-बाइंडिंग साइट से जुड़ते हैं और सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन और गतिशील टर्नओवर को अवरुद्ध करते हैं। यहां, 3-आयामी (3 डी) लाइव प्रीइंप्लांटेशन माउस भ्रूण में पीएसटी का आवेदन एक उपकोशिकीय स्तर पर सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क को बाधित करने के लिए निर्धारित किया गया है। यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक सेटअप के लिए निर्देश प्रदान करता है, साथ ही लाइव-सेल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पीएसटी के लिए प्रकाश सक्रियण और निष्क्रियता पैरामीटर भी प्रदान करता है। यह पुनरुत्पादन सुनिश्चित करता है और दूसरों को अपने शोध प्रश्नों पर इस प्रक्रिया को लागू करने में सक्षम बनाता है। पीएसटी जैसे अभिनव फोटोस्विच गतिशील इंट्रासेल्युलर सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क की समझ को आगे बढ़ाने और वास्तविक समय में साइटोस्केलेटन में गैर-आक्रामक रूप से हेरफेर करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित हो सकते हैं। इसके अलावा, पीएसटी अन्य 3 डी संरचनाओं जैसे ऑर्गेनोइड्स, ब्लास्टोइड्स, या अन्य प्रजातियों के भ्रूण में उपयोगी साबित हो सकते हैं।
Introduction
सूक्ष्मनलिकाएं आर्किटेक्चर विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में व्यापक रूप से भिन्न होती है ताकि विभिन्न कार्यों का समर्थन किया जा सके 1,2। विकास और संकुचन की इसकी गतिशील प्रकृति अतिरिक्त और इंट्रासेल्युलर संकेतों के लिए तेजी से अनुकूलन की अनुमति देती है और एक सेल की कभी-कभी बदलती जरूरतों का जवाब देती है। इसलिए, इसे “रूपात्मक फिंगरप्रिंट” के रूप में माना जा सकता है जो सेलुलर पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन के औषधीय लक्ष्यीकरण ने विकासात्मक जीव विज्ञान, स्टेम सेल जीव विज्ञान, कैंसर जीव विज्ञान और न्यूरोबायोलॉजी 3,4,5,6,7 में मौलिक खोजों की अधिकता को जन्म दिया है। यह दृष्टिकोण, जबकि अपरिहार्य है, विषाक्तता और ऑफ-टारगेट प्रभाव जैसी विभिन्न सीमाओं को प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सूक्ष्मनलिकाएं-लक्ष्यीकरण एजेंटों में से एक, नोकोडाज़ोल, एक शक्तिशाली सूक्ष्मनलिकाएं-डीपोलीमराइजिंग दवा8 है। हालांकि, छोटे-अणु अवरोधक जैसे कि नोकोडाज़ोल आवेदन के समय से सक्रिय होते हैं और, कई महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों के लिए सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन की आवश्यक प्रकृति को देखते हुए, सूक्ष्मनलिकाएं का वैश्विक डीपोलीमराइजेशन ऑफ-टारगेट प्रभाव पैदा कर सकता है, जो कई अनुप्रयोगों के लिए अनुपयुक्त हो सकता है। इसके अतिरिक्त, nocodazole उपचार अपरिवर्तनीय है जब तक कि नमूनों को दवा से मुक्त नहीं किया जाता है, निरंतर लाइव इमेजिंग को रोकता है और इस प्रकार, व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं फिलामेंट्स की सटीक ट्रैकिंग को रोकता है।
प्रकाश-सक्रिय यौगिकों का विकास फोटोअनकेड अणुओं के निर्माण के साथ शुरू हुआ और एक सटीक और स्पैटिओटेम्पोरल रूप से नियंत्रित तरीके से सूक्ष्मनलिकाएं विकास निषेध के प्रभावों को लक्षित करने और निगरानी करने में एक नए युग की शुरुआत की है। प्रतिवर्ती फोटोस्विचेबल दवाओं, फोटोस्टैटिन (पीएसटी) का एक परिवार, एज़ोबेंजीन 9 के साथ कोम्ब्रेटास्टेटिन ए -4 के स्टिलबेन घटक को बदलकर विकसितकिया गया था। पीएसटी यूवी प्रकाश के साथ रोशनी तक निष्क्रिय होते हैं, जिससे निष्क्रिय ट्रांस-कॉन्फ़िगरेशन प्रतिवर्ती आइसोमेराइजेशन द्वारा सक्रिय सीआईएस-कॉन्फ़िगरेशन में परिवर्तित हो जाता है। सीआईएस-पीएसटी β-ट्यूबुलिन की कोलचिसिन बाइंडिंग साइट को बाध्य करके सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन को बाधित करते हैं, β-ट्यूबुलिन के साथ अपने इंटरफ़ेस को अवरुद्ध करते हैं और सूक्ष्मनलिकाएं विकास के लिए आवश्यक dimerization को रोकतेहैं। पीएसटी के एक समूह के बीच, पीएसटी -1 पी एक लीड यौगिक के रूप में उभरा है क्योंकि इसमें उच्चतम शक्ति है, पूरी तरह से पानी में घुलनशील है, और रोशनी के बाद बायोएक्टिविटी की तेजी से शुरुआत दिखाता है।
पीएसटी का सबसे प्रभावी ट्रांस-टू-सीआईएस-आइसोमेराइजेशन 360-420 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य पर होता है, जो पीएसटी सक्रियण के लिए दोहरे विकल्पों को सक्षम बनाता है। एक ठेठ confocal माइक्रोस्कोप पर एक 405 एनएम लेजर लाइन सूक्ष्मनलिकाएं विकास निषेध के इष्टतम स्थानिक लक्ष्यीकरण के लिए प्रशासित किया जा सकता है। 405 एनएम लेजर रोशनी के माध्यम से पीएसटी सक्रियण के स्थान और समय को इंगित करने की क्षमता सटीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण की सुविधा प्रदान करती है, जिससे उप-द्वितीय प्रतिक्रिया समय 9 के भीतर उपकोशिकीय स्तर पर सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता का विघटनहोता है। वैकल्पिक रूप से, एक सस्ती एलईडी यूवी प्रकाश पूरे जीव रोशनी को सूक्ष्मनलिकाएं वास्तुकला के जीव-व्यापी व्यवधान को प्रेरित करने की अनुमति देता है। यह शोधकर्ताओं के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प हो सकता है, जिनके लिए स्थानिक लक्ष्यीकरण के बजाय निषेध की सटीक समय पर शुरुआत, लक्ष्य है। पीएसटी की एक और विशेषता 510-540 एनएम रेंज9 में तरंग दैर्ध्य के हरे रंग की रोशनी को लागू करके उनकी ऑन-डिमांड निष्क्रियता है। यह पीएसटी-मध्यस्थता विकास निषेध से पहले, दौरान, और बाद में सूक्ष्मनलिकाएं फिलामेंट्स का पता लगाने में सक्षम बनाता है।
PSTs, जबकि अभी भी एक अपेक्षाकृत हाल के डिजाइन, विविध अनुसंधान क्षेत्रों में कई इन विट्रो अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गयाहै 11, amoeboids12 में सेल माइग्रेशन के नए तंत्र की जांच सहित, नवजात माउस13 के मस्तिष्क से अलग न्यूरॉन्स में, और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर14 में विंग उपकला विकास . अन्य प्रकाश-प्रतिक्रियाशील दवाएं सेलुलर फ़ंक्शन के लक्षित व्यवधान में मूल्यवान उपकरण साबित हुई हैं। उदाहरण के लिए, ब्लेबिस्टाटिन का एक एनालॉग, azidoblebbistatin, रोशनी15,16 के तहत बढ़े हुए मायोसिन निषेध के लिए उपयोग किया गया था। यह सेलुलर फ़ंक्शन के स्पैटिओटेम्पोरल रूप से नियंत्रित निषेध की क्षमता के कारण नई खोजों की क्षमता पर प्रकाश डालता है।
लाइव 3 डी जीव शारीरिक परिस्थितियों में एक पूरे जानवर, एकल-कोशिका, या उपकोशिकीय स्तर पर सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता में हेरफेर करने के लिए शानदार अभी तक अधिक नाजुक प्रणालियों को प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण सेल के आंतरिक कामकाज के साथ-साथ एक जीव17 के भीतर अंतरकोशिकीय संबंधों में असाधारण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। अस्थायी और स्थानिक रूप से पीएसटी के सक्रियण और निष्क्रियता के लगातार चक्रों को लक्षित करने में योगदान दिया इंटरफेज ब्रिज, कोशिकाओं के बीच एक पोस्ट-साइटोकाइनेटिक संरचना, प्रीइंप्लांटेशन माउस भ्रूण16 में एक गैर-सेंट्रोसोमल सूक्ष्मनलिकाएं-आयोजन केंद्र के रूप में। एक समान प्रयोगात्मक सेटअप ने ब्लास्टोसिस्टगठन की अनुमति देने के लिए माउस भ्रूण की सीलिंग में बढ़ती सूक्ष्मनलिकाएं की भागीदारी का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, पीएसटी का उपयोग पूरे ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में भी किया गया था ताकि हिंडब्रेन19 में कोशिकाओं के सबसेट में सूक्ष्मनलिकाएं विकास को रोककर न्यूरोनल सेल माइग्रेशन की जांच की जा सके।
यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक सेटअप और प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण में पीएसटी -1 पी के उपयोग का वर्णन करता है। यहां प्रस्तुत निर्देश भी उद्देश्यों की एक विस्तृत सरणी के लिए पीएसटी के आवेदन का मार्गदर्शन कर सकते हैं जैसे कि गुणसूत्र अलगाव और सेल विभाजन का अध्ययन, इंट्रासेल्युलर कार्गो की तस्करी, और सेल मॉर्फोजेनेसिस और माइग्रेशन। इसके अलावा, इस तरह के अध्ययन ऑर्गेनोइड सिस्टम, ब्लास्टोइड्स और अन्य भ्रूण मॉडल जैसे कि केनोरहाबडिटिस एलिगेंस और ज़ेनोफस लेविस में पीएसटी के कार्यान्वयन में सहायता करेंगे, साथ ही संभावित रूप से इन विट्रो निषेचन प्रौद्योगिकियों के लिए पीएसटी के उपयोग का विस्तार करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क एक सेल के मौलिक आंतरिक कामकाज के लिए अभिन्न अंग है। नतीजतन, यह जीवित जीवों में सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता में हेरफेर करने में चुनौतियों को प्रस्तुत करता है, क्योंकि नेटवर्क के लि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को धन्यवाद देना चाहते हैं डॉ ओलिवर थॉर्न-Seshold और ली गाओ हमें photostatins और पांडुलिपि की तैयारी पर सलाह के साथ प्रदान करने के लिए, फिल्मांकन समर्थन के लिए मोनाश उत्पादन, और माइक्रोस्कोपी समर्थन के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग.
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) परियोजना अनुदान APP2002507 द्वारा J.Z. और कनाडाई उन्नत अनुसंधान संस्थान (CIFAR) Azrieli छात्रवृत्ति J.Z. के लिए द्वारा समर्थित किया गया था। ऑस्ट्रेलियाई पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान विक्टोरिया की राज्य सरकार और ऑस्ट्रेलियाई सरकार से अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides – LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes – 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch – Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice – wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes – Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
- Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
- Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
- Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
- Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
- Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
- Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
- Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
- Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
- Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
- Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
- Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
- Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
- Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
- Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
- Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
- Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
- Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
- van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
- Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
- Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
- Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
- Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).
